EGCG-Cu對(duì)水中大腸桿菌的殺滅性能研究

冉強(qiáng)三，金紀(jì)玥，馮萃敏，郭子玉，李敬一，陳梓怡

(1.北京建筑大學(xué) 城市雨水系統(tǒng)與水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044；2.北京建筑大學(xué) 水環(huán)境國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 100044；3.北京市自來(lái)水集團(tuán)有限公司，北京 100031；4.北京市市政工程設(shè)計(jì)研究總院有限公司，北京 100082)

目前常用的飲用水消毒方式有氯消毒、臭氧消毒、紫外線(xiàn)消毒等[1]，但氯在消毒過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氯化消毒副產(chǎn)物[2-5]，臭氧和紫外線(xiàn)無(wú)持續(xù)消毒殺菌能力，無(wú)法保證飲用水的安全性[6-7]。進(jìn)入21世紀(jì)后，飲用水的安全標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步提升，目標(biāo)是發(fā)展更加綠色高效的飲用水消毒技術(shù)[8]。

茶多酚是一種新型、綠色、環(huán)保植物制劑[9-10]，大量研究表明，茶多酚除了有抗氧化性、抗老化、調(diào)血脂、抗腫瘤等作用外[11-14]，還具有強(qiáng)效的廣譜抑菌性[15-16]，具備良好的消毒效果且持續(xù)時(shí)間較久，其綠色、高效的特性使之可成為一種新型的飲用水輔助消毒劑或天然水源應(yīng)急消毒劑[17]。

茶多酚作為輔助消毒劑與管道釋放的金屬離子可能發(fā)生反應(yīng)，因此，選擇茶多酚中含量最多且在消毒過(guò)程中起主要作用的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)，使其與抗菌元素銅離子絡(luò)合，制備EGCG-Cu絡(luò)合物，研究EGCG-Cu絡(luò)合物的抑菌能力與抑菌機(jī)理，以促進(jìn)茶多酚及其絡(luò)合物在水消毒中的推廣應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

EGCG，生物制品；硫酸銅、碳酸氫鈉、乙醇均為分析純；大腸桿菌，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心生產(chǎn)(編號(hào)10004)；用作大腸桿菌計(jì)數(shù)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(二級(jí)品)，由6.6 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉、200 mL蒸餾水溶解、加熱滅菌而得；用作大腸桿菌復(fù)蘇培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(二級(jí)品)，由3.6 g肉湯培養(yǎng)基、200 mL蒸餾水溶解加熱滅菌而得；溶解藥劑與配制菌液的用水為蒸餾水。

DR6000紫外分光光度計(jì)；RT-6100酶標(biāo)儀；DYCP-33A電泳槽。

1.2 EGCG-Cu制備

采用水熱法由EGCG和硫酸銅溶液制備。EGCG 0.5 mmol用30 mL蒸餾水溶解，將1 mmol的硫酸銅配制成溶液后逐滴加入EGCG溶液中，混勻。用1 mol/L的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)溶液pH至7，在40 ℃下用恒溫磁力攪拌器攪拌1 h，使其充分絡(luò)合。沉淀用1∶1乙醇-水溶液洗滌，真空冷凍干燥12 h，得EGCG-Cu。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備 用無(wú)菌接種環(huán)沾取大腸桿菌，溶解后放入培養(yǎng)基中恒溫恒壓培養(yǎng)，得處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌懸液，菌數(shù)為106～108CFU/mL?？捎脽o(wú)菌生理鹽水稀釋待用。

1.3.2 最低抑菌濃度(MIC) 對(duì)104數(shù)量級(jí)的大腸桿菌菌懸液，配制一系列濃度的EGCG和EGCG-Cu溶液進(jìn)行MIC實(shí)驗(yàn)。

在無(wú)菌條件下，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂分裝在兩組培養(yǎng)皿中，將大腸桿菌菌懸液稀釋到104數(shù)量級(jí)，一組控制EGCG-Cu絡(luò)合物溶液濃度分別為0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L，另一組控制EGCG溶液濃度分別為0，125，250，500，1 000，2 000，4 000 mg/L。取100 μL的菌液涂于培養(yǎng)皿上，于37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效應(yīng) 1～6#錐形瓶分別加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和EGCG-Cu溶液，使EGCG-Cu濃度分別為0，10，20，30，40， 50 mg/mL。再向2～6#錐形瓶中分別加入5 mL大腸桿菌菌懸液，1#錐形瓶加入等體積生理鹽水。設(shè)定恒溫?fù)u床為37 ℃、180 r/min，定時(shí)取樣檢測(cè)OD500值，并繪制大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。

1.3.4 EGCG-Cu誘導(dǎo)大腸桿菌ROS的產(chǎn)生情況 采用活性氧酶聯(lián)免疫分析試劑盒，用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定胞內(nèi)活性氧簇(ROS)。

1.3.5 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響 取4組斜面保存的細(xì)菌溶于液體培養(yǎng)基，并經(jīng)恒溫?fù)u床于37 ℃活化，用生理鹽水稀釋至 103CFU/mL 數(shù)量級(jí)，分別加入EGCG-Cu配成濃度為100，50，25，0 mg/L的混合溶液，在不同的接觸時(shí)間(0，1，3，6，24，48 h)取樣，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌遺傳物質(zhì)的影響 大腸桿菌經(jīng)恒溫?fù)u床活化后分為三組，第一組加入EGCG，第二組加入EGCG-Cu，投加量分別為其最低抑菌濃度，第三組不做處理，作為空白對(duì)照。從三組大腸桿菌提取DNA做凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG和EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度

菌落生長(zhǎng)情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌落生長(zhǎng)情況

由表1可知，當(dāng)大腸桿菌為104數(shù)量級(jí)時(shí)，EGCG-Cu與EGCG的MIC濃度分別為200，1 000 mg/L。表明EGCG-Cu的抑菌效果明顯比EGCG好。其原因可能是金屬Cu離子與EGCG絡(luò)合，提高了EGCG的脂溶性，使其與大腸桿菌細(xì)胞膜更容易融合，提高了抑菌效果，從而降低了最低抑菌濃度[18]。

2.2 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

定時(shí)檢測(cè)OD500值，并繪制大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由圖1可知，空白組大腸桿菌在48 h內(nèi)表現(xiàn)出明顯的調(diào)整期、指數(shù)期和穩(wěn)定期；EGCG-Cu的投加使大腸桿菌的生長(zhǎng)周期曲線(xiàn)受到顯著影響。EGCG-Cu濃度的增加，使指數(shù)期推遲更多，且使大腸桿菌菌體細(xì)胞密度下降更多。當(dāng)EGCG-Cu投加量>30 mg/L 后，調(diào)整期>5 h，指數(shù)期的斜率明顯變緩，并且調(diào)整期與指數(shù)期不再有清晰界限；當(dāng)EGCG-Cu濃度為50 mg/L時(shí)，大腸桿菌在24 h內(nèi)始終處于調(diào)整期，且并未出現(xiàn)明顯的指數(shù)期。

2.3 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌中活性氧的影響

當(dāng)生物體在受到消毒劑的刺激后，其自身的損傷與氧化應(yīng)激效應(yīng)將發(fā)揮作用。氧化應(yīng)激是在由于體內(nèi)產(chǎn)生了較高濃度的活性氧化自由基(ROS)，而體內(nèi)抗氧化能力不足，導(dǎo)致ROS相對(duì)增加，從而導(dǎo)致了細(xì)胞或者組織受到損傷。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算出ROS值[19]，結(jié)果見(jiàn)圖2。

裝配式結(jié)構(gòu)工程仍處于探索階段，其設(shè)計(jì)形式和施工方法各不相同，結(jié)構(gòu)形式和施工方法也不同。有必要盡早改進(jìn)施工過(guò)程，突出制造結(jié)構(gòu)的優(yōu)越性。只有在施工過(guò)程中，通過(guò)不斷的探索，實(shí)施精細(xì)化施工，完善施工管理，尤其是要通過(guò)認(rèn)真細(xì)致的質(zhì)量監(jiān)理，對(duì)工程質(zhì)量從構(gòu)件進(jìn)場(chǎng)到安裝完成的各個(gè)施工環(huán)節(jié)通過(guò)實(shí)施檢查、驗(yàn)收、巡視、跟蹤和監(jiān)理，并及時(shí)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，調(diào)整策略予以應(yīng)對(duì)，才能使工程的施工質(zhì)量得以不斷地完善和提高。

圖2 大腸桿菌胞內(nèi)ROS的變化

由圖2可知，未投加消毒劑的空白組與對(duì)照組相比，大腸桿菌胞內(nèi)的ROS值始終保持較低的濃度，且基本沒(méi)有發(fā)生變化。在EGCG組中，大腸桿菌與其接觸2 h后，在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出較高濃度的ROS值，為28.63 IU/mL。從大量的研究可知，茶多酚在低濃度時(shí)具有較好的抗氧化性，而在高濃度時(shí)能促進(jìn)氧化作用，而在本實(shí)驗(yàn)中，投加的濃度為 1 mg/mL；在接觸6 h后，ROS值變化不大，可能是投加的EGCG濃度不高，并沒(méi)有完全殺滅大腸桿菌。在EGCG-Cu組中，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的ROS值隨著時(shí)間的變化，越來(lái)越大，是因?yàn)榻j(luò)合物中的銅元素也促進(jìn)了氧化作用。

2.4 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

蛋白質(zhì)是大腸桿菌最重要的組成部分之一，當(dāng)胞內(nèi)蛋白流失時(shí)，必將造成整個(gè)細(xì)胞的死亡。因此，培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)濃度可作為判斷大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)，進(jìn)而根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)結(jié)果，可判斷EGCG-Cu殺滅大腸桿菌的途徑。不同濃度EGCG-Cu與大腸桿菌接觸一定時(shí)間后，培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白質(zhì)濃度變化曲線(xiàn)

由圖3可知，投加EGCG-Cu的大腸桿菌溶液中蛋白質(zhì)的含量比空白組有明顯增加，且EGCG-Cu濃度越高，各時(shí)刻大腸桿菌溶液中蛋白質(zhì)的含量越高，表明EGCG-Cu投量越高，對(duì)細(xì)胞膜的破壞率越大。同時(shí)，EGCG-Cu濃度越高，大腸桿菌溶液中蛋白質(zhì)含量隨接觸時(shí)間而增加，其增加速率也越大，表明EGCG-Cu投量越高，對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用越迅速，破壞速率越大。證明EGCG-Cu的投加，使大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，導(dǎo)致菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的泄露，且這種破壞與EGCG-Cu的投加量和接觸時(shí)間息息相關(guān)。

2.5 EGCG-Cu對(duì)大腸桿菌遺傳物質(zhì)的影響

根據(jù)2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)試組加入EGCG濃度為1 000 mg/L，EGCG-Cu濃度為200 mg/L，提取EGCG處理組和EGCG-Cu處理組大腸桿菌的DNA，進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 DNA電泳圖

3 結(jié)論

(1)通過(guò)水熱法合成EGCG-Cu絡(luò)合物，探究了EGCG-Cu對(duì)細(xì)菌的殺滅性能。EGCG的MIC濃度為1 000 mg/L，EGCG-Cu為200 mg/L，表明EGCG-Cu的抑菌效果優(yōu)于EGCG，相同抑菌效果所需EGCG-Cu的濃度遠(yuǎn)低于EGCG。

(2)增大EGCG-Cu濃度，將使水中大腸桿菌菌體密度降低，EGCG-Cu濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，大腸桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段幾乎消失。EGCG-Cu殺滅大腸桿菌作用的重要體現(xiàn)是對(duì)細(xì)胞膜的破壞，并不是直接作用在其基因組。