EGCG-Cu對水中大腸桿菌的殺滅性能研究

冉強三，金紀玥，馮萃敏，郭子玉，李敬一，陳梓怡

(1.北京建筑大學 城市雨水系統與水環境教育部重點實驗室，北京 100044；2.北京建筑大學 水環境國家級實驗教學示范中心，北京 100044；3.北京市自來水集團有限公司，北京 100031；4.北京市市政工程設計研究總院有限公司，北京 100082)

目前常用的飲用水消毒方式有氯消毒、臭氧消毒、紫外線消毒等[1]，但氯在消毒過程中會產生氯化消毒副產物[2-5]，臭氧和紫外線無持續消毒殺菌能力，無法保證飲用水的安全性[6-7]。進入21世紀后，飲用水的安全標準進一步提升，目標是發展更加綠色高效的飲用水消毒技術[8]。

茶多酚是一種新型、綠色、環保植物制劑[9-10]，大量研究表明，茶多酚除了有抗氧化性、抗老化、調血脂、抗腫瘤等作用外[11-14]，還具有強效的廣譜抑菌性[15-16]，具備良好的消毒效果且持續時間較久，其綠色、高效的特性使之可成為一種新型的飲用水輔助消毒劑或天然水源應急消毒劑[17]。

茶多酚作為輔助消毒劑與管道釋放的金屬離子可能發生反應，因此，選擇茶多酚中含量最多且在消毒過程中起主要作用的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，使其與抗菌元素銅離子絡合，制備EGCG-Cu絡合物，研究EGCG-Cu絡合物的抑菌能力與抑菌機理，以促進茶多酚及其絡合物在水消毒中的推廣應用。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

EGCG，生物制品；硫酸銅、碳酸氫鈉、乙醇均為分析純；大腸桿菌，中國工業微生物菌種保藏管理中心生產(編號10004)；用作大腸桿菌計數的營養瓊脂培養基(二級品)，由6.6 g營養瓊脂粉、200 mL蒸餾水溶解、加熱滅菌而得；用作大腸桿菌復蘇培養的營養肉湯培養基(二級品)，由3.6 g肉湯培養基、200 mL蒸餾水溶解加熱滅菌而得；溶解藥劑與配制菌液的用水為蒸餾水。

DR6000紫外分光光度計；RT-6100酶標儀；DYCP-33A電泳槽。

1.2 EGCG-Cu制備

采用水熱法由EGCG和硫酸銅溶液制備。EGCG 0.5 mmol用30 mL蒸餾水溶解，將1 mmol的硫酸銅配制成溶液后逐滴加入EGCG溶液中，混勻。用1 mol/L的碳酸氫鈉調節溶液pH至7，在40 ℃下用恒溫磁力攪拌器攪拌1 h，使其充分絡合。沉淀用1∶1乙醇-水溶液洗滌，真空冷凍干燥12 h，得EGCG-Cu。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液制備 用無菌接種環沾取大腸桿菌，溶解后放入培養基中恒溫恒壓培養，得處于對數增長期的菌懸液，菌數為106～108CFU/mL。可用無菌生理鹽水稀釋待用。

1.3.2 最低抑菌濃度(MIC) 對104數量級的大腸桿菌菌懸液，配制一系列濃度的EGCG和EGCG-Cu溶液進行MIC實驗。

在無菌條件下，將營養瓊脂分裝在兩組培養皿中，將大腸桿菌菌懸液稀釋到104數量級，一組控制EGCG-Cu絡合物溶液濃度分別為0，12.5，25，50，100，200，400 mg/L，另一組控制EGCG溶液濃度分別為0，125，250，500，1 000，2 000，4 000 mg/L。取100 μL的菌液涂于培養皿上，于37 ℃的環境中培養24 h，觀察菌落的生長情況。

1.3.3 EGCG-Cu對大腸桿菌的生長抑制效應 1～6#錐形瓶分別加入營養肉湯培養基和EGCG-Cu溶液，使EGCG-Cu濃度分別為0，10，20，30，40， 50 mg/mL。再向2～6#錐形瓶中分別加入5 mL大腸桿菌菌懸液，1#錐形瓶加入等體積生理鹽水。設定恒溫搖床為37 ℃、180 r/min，定時取樣檢測OD500值，并繪制大腸桿菌生長曲線圖。

1.3.4 EGCG-Cu誘導大腸桿菌ROS的產生情況 采用活性氧酶聯免疫分析試劑盒，用酶標儀在 450 nm 波長下測定吸光度(OD值)，根據標準曲線確定胞內活性氧簇(ROS)。

1.3.5 EGCG-Cu對大腸桿菌細胞膜通透性的影響 取4組斜面保存的細菌溶于液體培養基，并經恒溫搖床于37 ℃活化，用生理鹽水稀釋至 103CFU/mL 數量級，分別加入EGCG-Cu配成濃度為100，50，25，0 mg/L的混合溶液，在不同的接觸時間(0，1，3，6，24，48 h)取樣，以考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。

1.3.6 EGCG-Cu對大腸桿菌遺傳物質的影響 大腸桿菌經恒溫搖床活化后分為三組，第一組加入EGCG，第二組加入EGCG-Cu，投加量分別為其最低抑菌濃度，第三組不做處理，作為空白對照。從三組大腸桿菌提取DNA做凝膠電泳分析。

2 結果與討論

2.1 EGCG和EGCG-Cu對大腸桿菌的最低抑菌濃度

菌落生長情況實驗結果見表1。

表1 菌落生長情況

由表1可知，當大腸桿菌為104數量級時，EGCG-Cu與EGCG的MIC濃度分別為200，1 000 mg/L。表明EGCG-Cu的抑菌效果明顯比EGCG好。其原因可能是金屬Cu離子與EGCG絡合，提高了EGCG的脂溶性，使其與大腸桿菌細胞膜更容易融合，提高了抑菌效果，從而降低了最低抑菌濃度[18]。

2.2 EGCG-Cu對大腸桿菌的生長抑制效應

定時檢測OD500值，并繪制大腸桿菌生長曲線，見圖1。

圖1 大腸桿菌生長曲線

由圖1可知，空白組大腸桿菌在48 h內表現出明顯的調整期、指數期和穩定期；EGCG-Cu的投加使大腸桿菌的生長周期曲線受到顯著影響。EGCG-Cu濃度的增加，使指數期推遲更多，且使大腸桿菌菌體細胞密度下降更多。當EGCG-Cu投加量>30 mg/L 后，調整期>5 h，指數期的斜率明顯變緩，并且調整期與指數期不再有清晰界限；當EGCG-Cu濃度為50 mg/L時，大腸桿菌在24 h內始終處于調整期，且并未出現明顯的指數期。

2.3 EGCG-Cu對大腸桿菌中活性氧的影響

當生物體在受到消毒劑的刺激后，其自身的損傷與氧化應激效應將發揮作用。氧化應激是在由于體內產生了較高濃度的活性氧化自由基(ROS)，而體內抗氧化能力不足，導致ROS相對增加，從而導致了細胞或者組織受到損傷。用酶標儀測定吸光度，計算出ROS值[19]，結果見圖2。

裝配式結構工程仍處于探索階段，其設計形式和施工方法各不相同，結構形式和施工方法也不同。有必要盡早改進施工過程，突出制造結構的優越性。只有在施工過程中，通過不斷的探索，實施精細化施工，完善施工管理，尤其是要通過認真細致的質量監理，對工程質量從構件進場到安裝完成的各個施工環節通過實施檢查、驗收、巡視、跟蹤和監理，并及時進行經驗總結，調整策略予以應對，才能使工程的施工質量得以不斷地完善和提高。

圖2 大腸桿菌胞內ROS的變化

由圖2可知，未投加消毒劑的空白組與對照組相比，大腸桿菌胞內的ROS值始終保持較低的濃度，且基本沒有發生變化。在EGCG組中，大腸桿菌與其接觸2 h后，在細胞內檢測出較高濃度的ROS值，為28.63 IU/mL。從大量的研究可知，茶多酚在低濃度時具有較好的抗氧化性，而在高濃度時能促進氧化作用，而在本實驗中，投加的濃度為 1 mg/mL；在接觸6 h后，ROS值變化不大，可能是投加的EGCG濃度不高，并沒有完全殺滅大腸桿菌。在EGCG-Cu組中，大腸桿菌細胞內的ROS值隨著時間的變化，越來越大，是因為絡合物中的銅元素也促進了氧化作用。

2.4 EGCG-Cu對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

蛋白質是大腸桿菌最重要的組成部分之一，當胞內蛋白流失時，必將造成整個細胞的死亡。因此，培養基中蛋白質濃度可作為判斷大腸桿菌細胞膜完整性的指標，進而根據蛋白質濃度的檢測結果，可判斷EGCG-Cu殺滅大腸桿菌的途徑。不同濃度EGCG-Cu與大腸桿菌接觸一定時間后，培養基中蛋白質濃度的檢測結果見圖3。

圖3 蛋白質濃度變化曲線

由圖3可知，投加EGCG-Cu的大腸桿菌溶液中蛋白質的含量比空白組有明顯增加，且EGCG-Cu濃度越高，各時刻大腸桿菌溶液中蛋白質的含量越高，表明EGCG-Cu投量越高，對細胞膜的破壞率越大。同時，EGCG-Cu濃度越高，大腸桿菌溶液中蛋白質含量隨接觸時間而增加，其增加速率也越大，表明EGCG-Cu投量越高，對細胞膜的破壞作用越迅速，破壞速率越大。證明EGCG-Cu的投加，使大腸桿菌細胞膜的完整性遭到破壞，導致菌體內蛋白質的泄露，且這種破壞與EGCG-Cu的投加量和接觸時間息息相關。

2.5 EGCG-Cu對大腸桿菌遺傳物質的影響

根據2.1節實驗結果，測試組加入EGCG濃度為1 000 mg/L，EGCG-Cu濃度為200 mg/L，提取EGCG處理組和EGCG-Cu處理組大腸桿菌的DNA，進行凝膠電泳檢測，結果見圖4。

圖4 DNA電泳圖

3 結論

(1)通過水熱法合成EGCG-Cu絡合物，探究了EGCG-Cu對細菌的殺滅性能。EGCG的MIC濃度為1 000 mg/L，EGCG-Cu為200 mg/L，表明EGCG-Cu的抑菌效果優于EGCG，相同抑菌效果所需EGCG-Cu的濃度遠低于EGCG。

(2)增大EGCG-Cu濃度，將使水中大腸桿菌菌體密度降低，EGCG-Cu濃度達到50 mg/L時，大腸桿菌的對數生長階段幾乎消失。EGCG-Cu殺滅大腸桿菌作用的重要體現是對細胞膜的破壞，并不是直接作用在其基因組。