工業酶制劑的發展與應用研究

趙琳，宋瑞瑞，吳希，吳琦，云振宇

(中國標準化研究院 農業食品標準化研究所，北京 100191)

酶制劑是現代生物技術快速發展的產物。從古代開始，在自然界中發現的酶，包括來源于微生物及動植物如小牛的瘤胃或木瓜中的酶，就被應用于奶酪、葡萄酒、醋等食物的生產，以及日用品如皮革、靛藍和亞麻布等的制造。由于技術的限制，人們對這些酶的特性認識不足，更沒有純化及表征手段。20世紀后半葉，隨著發酵工程的發展和表征技術的成熟，酶制劑被逐漸發現、純化和應用，實現了利用菌株進行大規模生產。隨著生物技術和計算機科學等現代化技術的成熟和發展，人們挖掘出越來越多的酶制劑，并且利用隨機突變、理性設計或半理性設計等技術改造現有的酶[1-4]。酶制劑的底物譜越來越廣泛，催化類型更加多樣化，能夠適用于多種反應條件，甚至可以在極端條件下保持催化活性，這使得酶制劑真正進入到洗滌劑[5-6]、飼料[7-9]、食品[10-11]、紡織[12-14]等工業產品和生產過程中。酶制劑的使用不僅改變了各行各業的生產方式，也促使人類的飲食結構及生活方式發生了巨大的改變。

1 酶的分類

隨著生物化學、分子生物學等生命科學與技術的發展，人們對生物酶有了更好的認知和分離純化手段，應用的酶的種類大幅增加。國際生物化學與分子生物學聯盟(IUBMB)根據酶催化反應的類型將酶分為六大類[15]。

1.1 氧化還原酶

所有催化氧化還原反應的酶都屬于這個分類，如乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等，氧化的底物作為氫供體。

1.2 轉移酶

轉移酶是將一個基團如甲基基團或糖基基團從一個化合物(供體)轉移到另一個化合物(受體)的酶，如磷酸化酶、轉氨酶、轉甲基酶等。

1.3 水解酶

這些酶催化水解使C—O、C—N、C—C、磷酸鍵或其他鍵斷裂，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等。

1.4 裂解酶

裂解酶是通過消除、形成雙鍵或環狀結構、在雙鍵上增加基團等方式使 C—C、C—O、C—N或其他鍵斷裂，如檸檬酸合成酶、醛縮酶等。

1.5 異構酶

這些酶催化分子內部結構變化，如磷酸丙糖異構酶等。

1.6 連接酶

連接酶催化兩個分子的連接。連接反應通常與ATP或三磷酸鹽的分解相偶聯，如谷氨酰胺合成酶等。

因酶催化作用具有高效、專一、條件溫和、催化活性可控等優點，其被廣泛應用到各種工業化生產加工過程中。工業酶制劑大多數都是起水解作用的，用來對多種天然產物進行降解，其中蛋白酶主要在清潔劑和乳制品行業中廣泛應用，淀粉酶和纖維素酶主要在淀粉轉化、紡織品和食品等行業應用；在食品工業中經常應用的酶類還有脫氫酶類、氧化酶類、過氧化物酶類及氧合酶類等，如乳酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、脂肪氧合酶等，僅次于水解酶的應用。

2 工業酶的生產

工業酶是利用細菌、真菌等微生物在嚴格控制的條件下發酵產生。實踐生產中絕大多數微生物酶都集中來自特定的屬，其中曲霉、木霉屬、芽孢桿菌和酵母菌物種占主要部分[16]。在選擇生產菌株時必須從幾個方面考慮：理想情況下，酶由細胞分泌，這會使得回收和純化過程比細胞內酶的生產要簡單得多，因為細胞內酶必須從成千上萬種不同的細胞蛋白和組分中純化；其次，生產宿主須是GRAS狀態(一般被認為是安全的)，尤其是生物體生產的酶要用于食品加工過程；第三，生物體需要能夠在合理時間內產生大量的所需的酶[17]。

工業中使用的許多微生物都被改造以高效率生產所需酶，同時不產生其它副產品。Leisola等[18]將酶生產過程分為以下幾個階段(圖1)：①酶的選擇；②生產菌株的選擇；③利用生物工程技術構建高產菌株；④培養基及生產條件優化；⑤回收工藝優化；⑥利用穩定劑等方法增加酶的穩定性。

圖1 工業酶制劑生產過程

工業酶的選擇標準需要考慮其特異性、反應速率、pH值與溫度、穩定性、抑制劑的效果和對底物的親和力等[18]。同樣，也可以通過改進生產酶的技術來適應工業生產中化學反應的類型和操作條件，如溫度、pH值和反應動力學等。在過去的幾十年里，酶技術領域的深入研究為改善酶的實際應用效果提供了許多可行的方法。其中，固定催化技術的發展為開發更高效的、經濟的，能應用于工業、廢物處理、醫藥、生物傳感器的生物催化劑提供了可能[19-20]。現在已經開發出許多可用于固定酶的技術手段，大致可分為四大類，即包封、共價結合、交聯和吸附。特定技術的選擇取決于酶的性質、底物的性質和酶的最終用途[21-22]。D′Souza[23]指出，酶固定化是將酶和固定基質相結合，使酶在生物反應器中保持穩定，并且能夠重復利用。固定化通常能穩定酶的結構，使酶能在極端的pH、溫度或特定有機溶劑等條件下工作，而且能夠獲得高純度的產品，尤其食品加工和制藥行業中產品的純度非常重要，因為雜質會造成毒理、免疫學等嚴重問題，此外，酶固定化還能更好地控制酶促反應效率和反應時間，這在食品行業特別是在涉及易腐商品以及其他不穩定的底物，中間體或產品中具有重要意義[24]。

3 工業酶的應用

酶在工業用途中有著極大的吸引力，不僅因為酶對從底物到產物的生物轉化有高度選擇性和高效性，還因為酶催化是產物相對比較單一的反應，能夠最大限度地減少廢物產生。根據應用將工業酶簡單分為四大類，即洗滌用酶、技術酶、食品和飼料行業用酶。技術酶進一步分為紡織用酶、皮革用酶、造紙用酶、精細化學用酶、乙醇燃料生產用酶等[25]。表1 中所展示的是酶在多種工業環節中的應用及用途，酶工業已經是一個高度多樣化的產業，并且其在大小和復雜性方面仍在發展。

表1 在多種工業環節中應用的酶及用途

3.1 清潔劑工業

工業酶制劑被用來作為清潔劑的添加劑仍然是其最大的用途。蛋白酶、淀粉酶以及纖維素酶都能提供多種清潔效果，如有效地清除特殊污漬。蛋白酶一般源于動物內臟、植物莖葉和果實及微生物中，根據其最適反應的pH值可劃分為堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，堿性蛋白酶應用最廣泛。蛋白酶是催化肽鍵水解的酶，因此，可應用于織物上的汗漬、血漬、奶漬及其他食物汁液等的清洗；淀粉酶可將淀粉類污垢水解，并與其他酶有較好的兼容性，在洗滌工業中得到大量的應用；脂肪酶能將甘油三酯分解成易清除的脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯和甘油等，使得油污的清潔效果大大增加；纖維素酶在洗滌液中主要發揮柔軟、增色衣物的作用[26]。這些酶制劑可以滿足對清潔劑性能的要求，并且其組分也在不斷地發展。酶與清潔劑組分的兼容性(例如，典型的穩定性能)是影響酶制劑在清潔劑中使用的主要因素。最近第二代清潔用酶制劑，如新型淀粉酶，在低溫和堿性pH條件下的活性有了顯著提高，同時還保持著在清潔劑應用條件下必要的穩定性。這些新型酶制劑都是通過微生物菌種選育和蛋白質工程手段進行功效改善[27]。在低溫和堿性pH條件下顯示出活性與穩定性的蛋白酶也已經從自然界中分離出來，應用定向進化的方法來進一步對其優化改進[28]，使該類蛋白酶更適用于清潔劑工業。

此外，現階段人們生活方式發生很大的變化，產生的污漬不僅來源廣泛，成分也更復雜，通常包含有淀粉、蛋白質、色素、油污等多種成分，單一的酶制劑難以達到理性的去污效果，需要開發包含多種酶的復合酶制劑發揮協同作用[29]。但是目前我國大部分洗滌產品仍采用單一的酶制劑，只有少數洗滌產品同時使用了兩種酶，而在國外發達市場上的洗滌劑通常含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、甘露聚糖酶以及兩種不同功效的纖維素酶共7種酶制劑，因此，我國洗滌劑工業還未充分挖掘復合酶制劑的應用價值。

3.2 淀粉轉化

淀粉到果葡糖漿的酶轉化是一個確定的生物催化過程，淀粉工業過程中連續應用酶制劑是非常必要的。酶取代淀粉加工工業中的酸，不僅提高了催化效率，同時也降低了對環境的污染。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類的統稱，根據其作用的糖苷鍵和反應后產生的糖端基團不同可分為四類，即α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶[30]。目前，α-淀粉酶是我國生產量最大的工業酶制劑之一，也是淀粉工業中最為重要的酶制劑，淀粉水解轉化的第一步就是在α-淀粉酶的作用下轉化成為麥芽糊精，但伴隨著蒸汽的注入，使得對于酶的熱穩定性有很高的要求。應用傳統的α-淀粉酶時，pH值需要調整到一個很高的水平，并且必須添加鈣離子來穩定酶制劑。在淀粉工業中應用的酶制劑經歷著不斷地改進，性能得到優化的新的α-淀粉酶已經得到發展，例如提高了熱穩定性、耐酸性以及在不添加鈣離子的情況下發揮作用的能力[31-32]，從而為淀粉工業提供了顯著的效益。工業上通常利用枯草芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、米曲霉和黑曲霉來發酵生產淀粉酶，而α-淀粉酶主要源于芽孢桿菌屬。現代生物工程技術手段已經被應用來開發性能改善和產量高的α-淀粉酶[33-34]。常用的育種方式有從誘變育種、基因工程育種等，發酵生產方式有液體深層發酵、固態發酵等[30]。楊力權等從云南大理市彌渡縣石夾泉的55 ℃底泥中篩選出一株高溫淀粉酶的高產菌，經鑒定為蘇云金芽孢桿菌，產生的淀粉酶最適酶反應溫度為75 ℃，最適反應pH值為5.0，Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均對該酶活力具有促進作用，Fe2+對該酶具有明顯的促進作用，一定程度上擴大了淀粉酶的應用條件范圍[35]。

3.3 紡織應用

紡織行業巨大的能源和水資源消耗以及隨后的環境污染，使該行業處在相當大的能源環境壓力下。例如，在棉花的加工過程中，能源和水消耗最多的步驟之一是洗擦步驟，這一步驟在高溫和很強的堿性條件下進行，旨在清除多種在纖維素纖維上殘留的細胞壁成分。近些年，一個在更低的溫度下進行和應用更少的水的，以果膠裂解酶為基礎的加工過程已經廣泛應用[36]。應用酶制劑的新工藝已經被引進到棉紡織品制造業的主要加工過程中，這些酶制劑的應用對紡織工業和環境都是有益的。酶制劑在紡織品前處理過程即退漿、精煉、毛紡中炭化、絲綢脫膠、漂白等過程，以及紡織品后整理過程即改善纖維表面的外觀和手感、改善毛織物防氈縮等過程均有應用。如淀粉酶能夠催化織物上的淀粉漿料水解，常應用于退漿過程；果膠酶能夠清除織物表面的果膠質，常被應用于精煉過程；纖維素酶可以使纖維膨化，除去毛織物中的草刺等纖維物質，并改善纖維表面的外觀和手感等，在紡織品多個加工過程中均有應用[37]；漆酶可以對棉、麻、羊毛等多種天然纖維的疏水性、染色性、抗皺性、吸濕性等性能進行改良，以達到提高棉織物的漂白效果、增強紡織物的生物染色，紡織染料的脫色和脫毒等目的，是紡織工業中十分重要的酶制劑之一[38]。但是，單一酶制劑的催化作用相對專一，通常在應用過程中使用多種酶制劑，通過協同作用提高紡織加工效果。

3.4 飼料工業

飼料酶制劑作為安全、有效、無殘留的飼料添加劑已經被廣泛的應用于養殖業。酶制劑在飼料工業中的功能主要包括：營養利用、維持腸道健康、生理調控、免疫調控、脫毒解毒、抑菌殺菌以及抗氧化作用。單一種類的酶制劑功能存在局限性，因此常依據目的采用多種酶制劑或搭配其他相關制劑一起應用。此外酶作為飼料中抗生物素的替代品能夠有效地改善動物的營養物質代謝進而提高生產性能，增加抑菌、殺菌能力從而保持良好的健康狀態，具體表現在五個方面：即①提高動物體營養消化功能，改善動物體生產性能；②降低有害微生物的生長和繁殖；③降低日糧免疫原性應激，減少腸道壞死；④殺害病原菌；⑤產生功能性寡糖和寡肽，控制有害微生物[39]。例如，木聚糖酶和β-葡聚糖酶被應用在谷物為基礎的單胃動物飼料中，單胃動物與反芻動物相反，不能充分地降解和利用包含大量纖維素和半纖維素的植物基飼料。近些年天然磷的利用備受關注。全部植物85%～90%的磷存在于植酸磷中，動物自身不能分泌植酸酶，加之植酸磷會結合礦物質等其他營養物質，進一步降低了植酸磷的利用率，在飼料中添加植酸酶是提高植酸磷利用率的有效方式。在飼料中添加植酸酶不僅能夠增加植酸磷的利用率，而且降低了飼料中無機磷的添加，節約成本又減少磷排放，因此植酸酶已經發展成為飼料工業中最大的酶制劑部分[40]。隨著飼料酶制劑技術的發展，植酸酶的適用性和性能都得到了改善[41]。通過定點突變的新方法，研究人員制備出有更高催化活性的真菌性植酸酶。此外，磷的利用并不是動物飼料工業唯一關注的問題，研究人員一直努力探索從多種飼料來源中獲取更高的營養價值，例如增加大豆粉中蛋白質的可消化性。未來會有不同的水解酶應用到飼料工業中來增加原料的價值，從而降低每一個家畜的能源消耗和污染。

3.5 食品工業

食品工業中酶制劑的應用很廣泛，從釀酒與果汁等飲料工業、乳品工業到烘培工業、水產品加工、肉制品加工、油脂加工等多個行業。谷氨酰胺轉氨酶作為結構助劑應用到香腸、掛面和酸奶的加工過程中，通過蛋白的相互交聯可以為產品提高黏彈性能[42]。磷脂酶可以用來替代或補充傳統的乳化劑，因為這種酶可以原位降解極性小麥脂類來產生乳化的脂質。在烘焙工業中，面包中的淀粉和半纖維素負責水結合力和保水力，而它們分別是α-淀粉酶和木聚糖酶的底物，酶制劑的使用對于保持面包的柔軟度和彈性是非常重要的。此外，淀粉酶可以在某種程度上降解支鏈淀粉，從而在凝膠化作用后阻止再結晶，而非完全降解支鏈淀粉網絡，為面包提供彈性。在釀酒與果汁等飲料工業，蟲漆酶可以催化多酚類的交聯，通過過濾可以輕松地去除多酚，被用來進行果汁的澄凈以及啤酒中香味的增加。在脂肪和油類工業中，以粒化二氧化硅為基礎的固定化脂肪酶的加工過程顯著地降低了加工成本，并且基于這種新材料的加工過程現在正被應用于商品化不含反式脂肪酸的脂肪和油類的生產[43]。從食品加工過程角度分析，酶制劑在食品原料加工、食品生產過程以及食品保鮮等均有所應用。食品原料常用的酶制劑有果膠酶、乳糖酶、蛋白酶等，能改善食品原料的組織結構，進而提高食品品質和口感；食品生產過程中應用的酶制劑有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，主要應用于天然食品添加劑的制備過程，而在保健食品工業中，酶制劑的加入可以促使生物大分子的降解，以獲取具有特定生物功能的小分子物質，如氨基酸、多肽等，促進人體生命健康；食品保鮮中應用的酶有葡萄糖氧化酶、谷氨酰胺轉氨酶、溶菌酶等，避免營養成分因環境因素而破壞或者食品變質，抑制微生物的生長繁殖，保證食品質量和安全，延長食品的貨架期[44-45]。此外，應用高選擇性的微生物磷脂酶能有效清除植物油(脫膠)中的磷脂[46]，促進能源和水的節約，對工業和環境都極有益處。

3.6 有機合成中應用

化學合成被認為是應用酶催化最有前途的領域。雖然如此，化學工業實施酶制劑為基礎的進程緩慢，并且對酶的應用也慢于其他工業。酶制劑在這個領域的使用顯著增長以及以酶制劑為基礎的過程正被廣泛引進到多種多樣的化學品的生產中。脂肪酶對手性化合物具有較好的立體選擇性，如在藥品和農藥的制造生產中應用的單一對映體中間產物的產生過程，應用脂肪酶來生產乙醇和酰胺的對映異構體以及應用腈水解酶來生產半合成青霉素[47]；細胞色素P450能夠催化多種類型的反應，可識別芳香族、聚酮類、萜類、肽類、糖類等不同結構的底物，是自然界中催化性能最高的生物催化劑，在有機合成中也得到良好的應用[48]。

4 總結與展望

酶具有高效、專一、反應條件溫和、催化活性可控、綠色環保等特點，被廣泛應用于清潔劑、淀粉轉化、紡織、食品、有機合成等工業的生產加工過程中，為人類生活提供了極大便利。但由于工業條件中的底物濃度、剪切力、溫度、有機溶劑等各種因素的干擾，一定程度上也限制了現有酶制劑的應用。因此，一方面需要改善工業生產的工藝條件；另一方面，急需開發一批具有新活性的酶制劑，克服現有工業條件的限制。

生物信息學的進展和基因序列數據的挖掘分析極大地增加了從自然界中分離目標基因的效率。基于蛋白質結構以及其相關的生物化學與生物物理學性能的蛋白質工程技術為酶的優化提供了一個新的、有價值的工具，進一步改變了工業酶制劑的發展，使得提供特制的酶制劑成為可能，酶制劑具有新的活性并且適用于新的工藝條件，擴展了酶的工業用途。此外，隨著納米生物技術、分子定向進化、離子液體反應介質等技術的成熟和發展，酶制劑的產量、活性以及穩定性等均得到了極大的提高，將進一步擴大酶制劑的應用范圍，為現代工業高效生產提供有力保證。同時由于酶制劑結構和生產的復雜性，使得質量控制的復雜程度也相應提高。因此，建立酶制劑標準體系及研制重要質量標準對規范工業酶制劑行業、推動酶制劑的發展和應用有著重要意義。