PM2.5暴露對雄性大鼠生殖功能及IRE1-JNK通路相關蛋白表達的影響

楊 陽,劉福榮，崔留欣,黃 輝,李福琴

1)鄭州大學第一附屬醫院醫院感染管理科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院病案管理科 鄭州 450052 3)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 450001

近年來，世界男性精子質量呈逐年下降趨勢，不育癥的發病率逐年升高[1]。持續霾天氣對男性生殖功能的影響引起相關學者的關注[2]。細顆粒物(PM2.5)是造成健康風險最主要的大氣污染物之一，其極易富集多種有害物質并隨呼吸進入體內，直接或間接對機體多個系統造成損傷[3]。目前PM2.5對機體損傷的研究主要集中在呼吸系統、心血管系統和神經系統，有關其對雄性生殖系統損傷的研究尚處于探索階段。

內質網應激對精母細胞、睪丸結構及精子有影響，對雄性生殖有重要調節作用[4]。肌醇需求酶1(IRE1)是內質網應激的感應蛋白之一，屬于內質網膜Ⅰ型跨膜蛋白，嚴重或長時間內質網應激可引起IRE1過量表達，進而激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)表達[5]。本研究擬通過建立PM2.5暴露雄性大鼠生殖損傷模型，觀察采用IRE1抑制劑干預后，大鼠精子質量、組織形態、細胞凋亡、IRE1和JNK蛋白表達的變化，探討PM2.5是否通過激活IRE1-JNK通路介導生殖損傷，為PM2.5致雄性生殖損傷的防治提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1PM2.5采樣和處理2018年10月至2019年2月在鄭州市交通繁忙路段用大流量采樣器采集環境顆粒物，使用石英纖維濾膜進行采樣。將載有PM2.5的濾膜裁成1 cm×1 cm大小，浸泡于去離子蒸餾水中，超聲振蕩30 min×3次，振蕩液經6層紗布過濾，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，所得細顆粒懸浮液經真空冷凍干燥處理后，儲存于-20 ℃備用。根據實驗需求在使用前24 h內用無菌生理鹽水將PM2.5配成所需濃度后4 ℃保存，臨用前振蕩使顆粒物充分混勻。

1.2實驗動物來源及分組4周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體重90～110 g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物許可證編號：SCXK(豫)2017-0001。IRE1抑制劑STF083010購自美國MCE公司。大鼠于SPF級動物房飼養，自由飲水，經檢疫1周無異常后，采用隨機數字表法分成4組，每組10只。空白對照組氣管滴注生理鹽水；STF083010組腹腔注射1 mg/kg STF083010；PM2.5組氣管滴注PM2.5，劑量1.5 mg/kg；STF083010+PM2.5組先腹腔注射STF083010，后氣管滴注PM2.5。每周連續給藥5 d，停2 d，染毒時間為4周。

1.3標本取材染毒結束后，稱取大鼠體重，麻醉并處死后，立即打開腹腔，取睪丸、附睪，抽取腹主動脈血用于以下觀察和檢測。

1.4睪丸組織形態學觀察采用HE染色。取單側睪丸，置于體積分數10%甲醛中固定48 h，隨后依次進行組織浸蠟、切片、脫蠟水化、染色、脫水透明，干燥后于400倍光學顯微鏡下觀察生精上皮細胞形態結構、管腔細胞脫落情況等。

1.5睪丸組織細胞凋亡檢測采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)檢測睪丸組織細胞凋亡情況，操作過程按照試劑盒說明進行。于400倍光鏡下觀察，正常細胞為藍紫色，凋亡細胞為棕色并出現染色質濃縮、凋亡小體、細胞皺縮等。取3個視野，細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.6血清睪酮含量檢測取腹主動脈血約5 mL，3 000 r/min離心15 min，小心吸取血清，-20 ℃保存備用。采用ELISA法檢測血清睪酮含量，試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司，具體按試劑盒說明操作。

1.7精子質量分析用眼科鑷剝離一側附睪尾，制備精子濾液。采用電腦精子分析儀分析精子密度。于400倍光鏡下觀察精子活動率。取3個視野，精子活動率=活動精子數/(活動精子數+無活動精子數)×100%。于400倍光鏡下觀察精子形態，以大頭、雙頭、雙尾、卷尾、無鉤、香蕉形為精子畸形判斷依據。精子畸形率=畸形精子數/(正常精子數+畸形精子數)×100%。

1.8睪丸組織IRE1-JNK通路相關蛋白檢測取適量睪丸組織制備組織勻漿，加入裂解緩沖液，12 000 r/min、4 ℃離心5 min。吸取上清即為提取的睪丸組織總蛋白，用BCA法測蛋白濃度。總蛋白經SDS-PAGE電泳分離后，轉移到PVDF膜上。分別加入IRE1、JNK、p-JNK兔多克隆抗體(美國Immunoway 公司，均按1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床振蕩過夜，次日加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，用ECL化學發光法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像，Quanlity one軟件分析蛋白條帶灰度值。以β-actin為內參，目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。

1.9統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。4組大鼠的精子質量，血清睪酮含量，睪丸組織細胞凋亡率以及IRE1、JNK和p-JNK蛋白表達水平的比較采用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠睪丸組織形態學觀察結果空白對照組(圖1A1)生精細胞形態結構完整，生精小管充實飽滿，管壁光滑無皺褶，管腔細胞無脫落。STF083010組(圖1B1)生精小管排列規則，結構正常，由不同發育階段的生精細胞和支持細胞組成，在生精小管間的睪丸間質內，可見圓形或多邊形的睪丸間質細胞。PM2.5組(圖1C1)生精細胞間結構較為疏松，管內細胞間隙變大，生精上皮退化變性，細胞層數較空白對照組減少。STF083010+PM2.5組(圖1D1)生精細胞結構基本完整，管內細胞排列疏松但尚規則，管腔脫落細胞較PM2.5組減少。

A：空白對照組；B：STF083010組；C：PM2.5組；D：STF083010+PM2.5組；1：形態學觀察；2：細胞凋亡情況

2.2各組大鼠血清睪酮含量和睪丸組織細胞凋亡率的比較結果顯示，PM2.5可引起血清睪酮含量降低，睪丸組織細胞凋亡率升高；STF083010可拮抗PM2.5導致的血清睪酮含量下降和細胞凋亡，見表1。各組大鼠睪丸組織細胞凋亡情況見圖1。

表1 各組大鼠睪丸組織細胞凋亡情況

2.3各組大鼠精子質量分析PM2.5可降低精子密度及精子存活率，增高精子畸形率；而STF083010可拮抗PM2.5導致的精子密度、精子存活率降低及精子畸形率升高，見表2。

表2 各組大鼠精子質量結果比較

2.4各組大鼠睪丸組織中IRE1、p-JNK蛋白表達水平的比較見圖2、表3。PM2.5上調了IRE1、JNK、p-JNK蛋白表達水平，而STF083010抑制了PM2.5介導的IRE1、p-JNK蛋白表達的上調。

1～4:分別為空白對照組、STF083010組、PM2.5組、STF083010+PM2.5組

表3 各組大鼠睪丸組織中IRE1、JNK、p-JNK蛋白的表達

3 討論

PM2.5是霾形成的主要因素之一，治理霾的關鍵就是解決PM2.5問題。PM2.5粒徑小，比表面積大，易吸附重金屬等有毒有害物質，而生殖系統是重金屬毒害作用的主要靶器官之一[6]。意大利一項回顧性隊列研究[7]評估了空氣污染對精子參數的影響，結果顯示，PM2.5暴露水平與精子總數呈顯著負相關。文獻[8]分析了2013至2015年武漢地區大氣顆粒物與男性精子質量的暴露-反應關系，結果表明，PM2.5暴露濃度與精子質量呈負相關，尤其是精子濃度和精子數量。本研究選擇4周齡SD雄性大鼠，PM2.5染毒4周后，睪丸組織形態結構破壞，生精細胞數減少；睪丸組織細胞凋亡率升高；精子密度及精子存活率降低，精子畸形率升高；血清睪酮含量降低。上述證據進一步證實了PM2.5可引起雄性生殖損傷。STF083010與PM2.5聯合作用后大鼠精子質量﹑血清睪酮含量有所升高，睪丸組織病理損傷有所減輕，凋亡細胞減少，提示STF083010干預可拮抗PM2.5暴露引起的雄性大鼠生殖損傷。

目前PM2.5暴露對睪丸損傷的作用及其確切調控機制尚未完全闡明。有學者[9]研究發現，汽車尾氣來源的PM2.5通過激活PI3K/AKT信號通路，誘導睪丸支持細胞活性氧水平升高、細胞功能異常，破壞血睪屏障的完整性，最終導致生殖功能損傷。IRE1是內質網應激的感應蛋白之一。當出現嚴重或長時間內質網應激時，可引起感應蛋白IRE1的過量表達，活化的IRE1可與細胞凋亡信號調節激酶1(ASK1)形成IRE1-TRAF2-ASK1復合物，進而激活JNK[10]。本研究發現，PM2.5誘導可使大鼠睪丸組織中IRE1、JNK和p-JNK蛋白表達增強；采用IRE1抑制劑STF083010干預，在拮抗IRE1的同時，有效抑制了p-JNK蛋白表達水平，提示PM2.5可能通過活化IRE1、JNK介導雄性大鼠生殖損傷。

綜上，抑制IRE1-JNK通路可能能減輕PM2.5介導的雄性大鼠生殖損傷，這為PM2.5致生殖損傷的預防和治療提供了線索和思路。另外，JNK為MAPK家族的重要成員之一，除了與IRE1有關聯，還與自噬、氧化應激、線粒體及炎癥因子等多條信號通路有關[11]。JNK通路是否介導了其他信號通路共同參與PM2.5暴露后的生殖損傷，有待進一步探討。