基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接對(duì)當(dāng)歸飲子治療特應(yīng)性皮炎的作用機(jī)制研究

王子雯，許孟月，王海燕，劉學(xué)偉

1)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046 2)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 鄭州 450000

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，在我國(guó)的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[1-2]。其主要的臨床表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性濕疹、嚴(yán)重瘙癢、脫屑和皮膚干燥等[3]。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究[4]認(rèn)為，免疫失衡、皮膚屏障功能障礙、皮膚菌群紊亂是AD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，這些因素相互影響形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，AD的治療應(yīng)圍繞多因素、多靶點(diǎn)開(kāi)展。

當(dāng)歸飲子出自宋代《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方》，原方主治“心血凝滯，內(nèi)蘊(yùn)風(fēng)熱，皮膚瘡疥，或腫或癢，或膿水浸淫，或發(fā)赤疹瘩瘤”，具有養(yǎng)血活血、祛風(fēng)止癢之效，方中當(dāng)歸入肝脾經(jīng)，補(bǔ)血活血；白芍入肝脾血分，柔肝養(yǎng)血斂陰；川芎行氣活血祛風(fēng)，補(bǔ)血而不滯血；生地滋陰養(yǎng)血；何首烏養(yǎng)血祛風(fēng)；荊芥辛香散風(fēng)，苦溫清血，須防風(fēng)以散內(nèi)外之風(fēng)；蒺藜活血祛風(fēng)止癢；黃芪、甘草健脾益氣。全方補(bǔ)血活血兼健脾益氣以生血，補(bǔ)中有行；祛風(fēng)止癢又健脾實(shí)衛(wèi)以固表，補(bǔ)中兼疏。AD的中醫(yī)證型主要包括脾虛濕蘊(yùn)證、濕熱蘊(yùn)結(jié)證、血虛風(fēng)燥證等，其中血虛風(fēng)燥證為AD慢性期的主要證型[5]。當(dāng)歸飲子是治療血虛風(fēng)燥型皮膚疾病的經(jīng)典方劑，臨床研究[6-7]表明當(dāng)歸飲子治療血虛風(fēng)燥型AD可緩解患者癥狀、改善生活質(zhì)量、減緩復(fù)發(fā)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，當(dāng)歸飲子可影響血清IL-6、TNF-α水平，調(diào)節(jié)患者免疫功能[7]；抑制Th17細(xì)胞亞群失衡大鼠外周血IL-17、IL-23水平[8]；降低Ⅳ型過(guò)敏反應(yīng)模型小鼠血清IgE水平，抑制遲發(fā)過(guò)敏反應(yīng)[9]；此外，當(dāng)歸飲子可抑制致敏小鼠脾淋巴細(xì)胞釋放白三烯B4[10]。綜上所述，當(dāng)歸飲子具有調(diào)節(jié)免疫、抑制過(guò)敏及炎癥反應(yīng)的作用，但當(dāng)歸飲子治療AD的具體作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)，為觀察中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑干預(yù)和影響疾病網(wǎng)絡(luò)提供了重要支撐。本研究基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，探討當(dāng)歸飲子治療AD的作用機(jī)制，以期為后續(xù)的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1當(dāng)歸飲子活性成分的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集當(dāng)歸、白芍、川芎、荊芥、防風(fēng)、黃芪、蒺藜、甘草的全部化學(xué)成分，同時(shí)在化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)及文獻(xiàn)資料中收集生地黃、何首烏(制)的化學(xué)成分，以口服生物利用度≥30%且類(lèi)藥性≥0.18為條件進(jìn)行活性成分篩選。

1.2當(dāng)歸飲子活性成分靶點(diǎn)與AD疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)當(dāng)歸飲子活性成分的靶點(diǎn)，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)得到靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名，刪除無(wú)對(duì)應(yīng)基因名的靶點(diǎn)。以“atopic dermatitis”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://disgenet.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)進(jìn)行檢索，得到AD疾病靶點(diǎn)。

1.3活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0在線平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，獲得活性成分-疾病共同靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)?！肮?jié)點(diǎn)”代表當(dāng)歸飲子活性成分、疾病、靶點(diǎn),“邊”代表不同節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系。根據(jù)拓?fù)浞治鲋泄?jié)點(diǎn)的度(Degree)值和介數(shù)中心性的大小確定當(dāng)歸飲子中的關(guān)鍵活性成分。

1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選的活性成分-疾病共同靶點(diǎn)輸入STRING平臺(tái)(https://string-db.org)構(gòu)建靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)定蛋白種屬為“Homo sapiens”，篩選條件最低相互作用閾值為highest confidence，將結(jié)果保存為tsv格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2并利用Network Analyzer、Generate style from statistics工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并依據(jù)大于Degree值的2倍篩選核心靶點(diǎn)。

1.5核心靶點(diǎn)生物功能分析注釋利用R 3.6.2 clusterProfiler包對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6分子對(duì)接從PDB(https://www.rcsb.org/)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分與靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，并利用openbabel軟件轉(zhuǎn)換為pdb格式備用。將蛋白分子及配體分子的pdb文件導(dǎo)入AutoDock tolls 1.5.6處理并保存為pdbqt格式文件。運(yùn)行AutoDock Vina軟件，把處理好的活性化合物與靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，并運(yùn)用Discovery Studio 2020軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1當(dāng)歸飲子活性成分經(jīng)過(guò)篩選，共得到184個(gè)有效成分，其中當(dāng)歸2個(gè)、生地黃6個(gè)、白芍13個(gè)、川芎7個(gè)、荊芥11個(gè)、防風(fēng)18個(gè)、黃芪20個(gè)、蒺藜12個(gè)、何首烏(制)3個(gè)、甘草92個(gè)，去除重復(fù)值，共得到157個(gè)活性成分。

2.2當(dāng)歸飲子活性成分靶點(diǎn)與AD疾病靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)后通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，刪除51個(gè)無(wú)對(duì)應(yīng)基因名的靶點(diǎn)，最后得到232個(gè)活性成分靶點(diǎn)。以“atopic dermatitis”為檢索詞在GeneCards、DisGeNET、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到了53、752、1 495個(gè)與AD相關(guān)的基因，去除重復(fù)后得到1 779個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)將232個(gè)活性成分靶點(diǎn)與1 779個(gè)疾病靶點(diǎn)輸入Venny2.1.0中，得到129個(gè)共同靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析節(jié)點(diǎn)平均Degree值為9.939 849，節(jié)點(diǎn)平均介數(shù)中心性為0.002 679，大于平均度Degree值與平均介數(shù)中心性的節(jié)點(diǎn)共13個(gè)，為當(dāng)歸飲子的關(guān)鍵活性成分，見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸飲子的關(guān)鍵活性成分

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選經(jīng)分析，初步獲得一個(gè)113個(gè)節(jié)點(diǎn)、572條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)二次篩選,得到12個(gè)節(jié)點(diǎn)、52條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，這12個(gè)節(jié)點(diǎn)即為核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1和表2。

STAT3：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；AKT：蛋白激酶B

表2 當(dāng)歸飲子PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)的Degree值

2.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果選取GO功能富集分析前20(表3)做條形圖。由結(jié)果可知富集最多的有6個(gè)，主要涉及MAPK、AKT活性和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

表3 GO富集分析結(jié)果前20條目

選取KEGG通路富集分析排名前20(表4)做氣泡圖，篩選出通路92條，其中富集最多的有10個(gè)，與當(dāng)歸飲子治療AD密切相關(guān)的通路主要包括Toll樣受體、TNF、 IL-17、Th17、Th1/Th2細(xì)胞分化信號(hào)通路等。

表4 KEGG富集分析結(jié)果前20條目

2.6分子對(duì)接結(jié)果選取Degree值排名前3的關(guān)鍵活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前6的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。將每組結(jié)合能最低的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行展示，發(fā)現(xiàn)P65與山柰酚的結(jié)合能力最強(qiáng)。當(dāng)歸飲子成分與靶標(biāo)的結(jié)合親和力均小于-5 kcal/mol，說(shuō)明篩選的核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分具有良好的親和力。MAPK1與木樨草素分別在ASP111、CYS166、LYS54處形成氫鍵；TNF與木樨草素分別在TYR151、GLN61處形成氫鍵；JUN與木樨草素分別在ASN156、MET111、ASN119處形成氫鍵；P65與山柰酚TYR285、HIS252處形成氫鍵；STAT3與木樨草素分別在GLU360、MET99處形成氫鍵；MAPK3與木樨草素分別在GLU360、MET99處形成氫鍵GLU50、ASP123、MET125形成氫鍵。

3 討論

目前有關(guān)當(dāng)歸飲子治療AD的研究主要圍繞臨床觀察，具體的作用機(jī)制亟待進(jìn)一步深入探討。本研究通過(guò)對(duì)當(dāng)歸飲子治療AD的活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸飲子治療AD的13個(gè)關(guān)鍵活性成分，包括槲皮素、木樨草素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、刺芒柄花素等。其中槲皮素、山柰酚、木樨草素、柚皮素、甘草查爾酮A均為黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗菌、抗氧化等多種作用[11]。槲皮素可以調(diào)節(jié)Th1/Th2穩(wěn)定性，并減少B細(xì)胞釋放抗原特異性IgE抗體[12]。木樨草素可降低血清IgE和IL-4水平，阻止表皮水分流失，發(fā)揮止癢與抗AD的作用[13]。山柰酚可通過(guò)抑制NF-κB、PI3K/Akt、MAPK、janus激酶等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)各種急慢性炎癥性疾病起到治療作用[14]。漢黃芩素可抑制炎癥相關(guān)的酶，如環(huán)氧合酶(COX)的活性，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，治療皮膚炎癥性疾病[15]，還可平衡Th1/Th2細(xì)胞因子，抑制肥大細(xì)胞釋放組胺而治療過(guò)敏性疾病[16]。柚皮素可抑制CD4+T細(xì)胞活化和血清IgE、IFN-γ水平，減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕AD樣皮損[17]。刺芒柄花素可抑制上皮衍生的TSLP、IL-33等細(xì)胞因子，減輕過(guò)敏性疾病[18]。這些成分均具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，可能是當(dāng)歸飲子治療AD的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示核心靶點(diǎn)包括STAT3、P65、MAPK1、MAPK3、TNF、IL-6等。STAT3屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族，參與炎癥、免疫、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程，可通過(guò)調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞分化、加強(qiáng)皮膚屏障功能及刺激各種趨化因子、炎性因子分泌等影響AD疾病的進(jìn)程[19]。P65屬于NF-κB家族，廣泛存在于多種生物學(xué)過(guò)程中，通常處于非活性狀態(tài)，可由多種刺激激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)。STAT3和NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可激活炎癥因子，如COX-2、TNF-α、IL-6等[20]。有研究[21]發(fā)現(xiàn)與健康皮膚相比，AD上皮細(xì)胞核中的P65水平升高。MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，是MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分，可被多種細(xì)胞外刺激激活而在炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Ryu等[22]發(fā)現(xiàn)在IL-33處理的角質(zhì)形成細(xì)胞中緊密連接蛋白Claudin-1(CLDN1)表達(dá)下調(diào)，且受到ERK、STAT3的調(diào)節(jié)。TNF可刺激免疫細(xì)胞分泌多種炎癥因子，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)。最近研究[23]發(fā)現(xiàn)TNF超家族的TWEAK可通過(guò)誘導(dǎo)Fn14參與AD炎癥反應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。IL-6參與免疫、炎癥、感染、組織重塑等多種過(guò)程。研究[24]發(fā)現(xiàn)IL-6與其配體結(jié)合后可激活JAK-STAT3信號(hào)通路，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞功能，影響慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生。上述的靶點(diǎn)可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、炎癥因子等多種途徑影響AD的發(fā)病，有望成為當(dāng)歸飲子治療AD的重要靶點(diǎn)。

KEGG通路富集分析Degree值排名前20且靶向AD的通路主要涉及IL-17、Th17、Toll樣受體、Th1/Th2細(xì)胞分化信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路與炎癥免疫應(yīng)答密切相關(guān)。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫紊亂、皮膚屏障受損、皮膚菌群失調(diào)等，多種T細(xì)胞免疫平衡失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞因子分泌異常是AD發(fā)病的重要機(jī)制，其中Th2免疫反應(yīng)在急性期AD中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[25]，慢性病變中，Th1、Th22、Th17的免疫反應(yīng)增強(qiáng)[26]，尤其在亞裔患者中顯示出更多的Th17免疫激活。IL-17信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)NF-κB、MAPK等下游基因的表達(dá)[27]；研究[28]發(fā)現(xiàn)IL-17可調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)，增加 IL-4及IgE的產(chǎn)生，刺激IL-8、TNF-α、TSLP、CXL17、CXCL10等炎癥因子的產(chǎn)生，抑制患者皮膚絲聚蛋白表達(dá)，加劇皮膚屏障缺陷，導(dǎo)致慢性特應(yīng)性皮炎的發(fā)展[29]。此外，AD患者外周血中Th17、IL-17細(xì)胞的表達(dá)較正常人升高[30]，并在AD發(fā)病中起到重要作用。Toll樣受體信號(hào)通路可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子及抗生物肽等，在皮膚免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。Toll樣受體2遺傳多態(tài)性可影響AD病情的發(fā)展，Toll樣受體2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常會(huì)降低皮膚緊密連接蛋白與抗菌肽水平，導(dǎo)致AD皮膚屏障缺陷，還可能導(dǎo)致AD免疫系統(tǒng)失衡[31-32]?？傊珹D的發(fā)病與上述通路密切相關(guān)。本研究的富集分析結(jié)果表明當(dāng)歸飲子活性成分的作用靶點(diǎn)也與上述通路相關(guān)。本研究的分子對(duì)接結(jié)果顯示，當(dāng)歸飲子治療AD的主要活性成分槲皮素、木樨草素、山柰酚與PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)STAT3、JUN、TNF、MAPK1、MAPK3、P65均有良好的親和力，提示其在治療過(guò)程可能起關(guān)鍵作用。

總之，當(dāng)歸飲子治療AD的主要活性成分可能為槲皮素、木樨草素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素等，這些活性成分通過(guò)作用于STAT3、P65、MAPK、TNF、IL-6、IL-17、Toll樣受體、Th17等靶點(diǎn)和信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)AD的干預(yù)作用。本研究?jī)H依靠網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)當(dāng)歸飲子治療AD的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，仍需進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)研究的觀察與佐證。