一種胚胎透明帶硬度無創測量方法的建立

梁詩豪，王 倩，崔趁趁，李艷如，張翠蓮，馮 若

1)鄭州大學基礎醫學院組織學與胚胎學系 鄭州 450001 2)河南省人民醫院生殖醫學中心 鄭州 450003

不孕不育困擾著許多已婚夫婦，輔助生殖技術的發展在一定程度上緩解了這一難題。然而，輔助生殖技術成功與否也受到許多因素制約，其中精準的胚胎評級就是一個重要的影響因素。通常，精子與卵子完成體外受精后，需在規定的時間內運用顯微鏡觀察胚胎發育狀態，綜合評估胚胎的發育潛力，包括胚胎的形態學特征諸如原核消失時間、多核、卵裂情況、卵裂細胞數及碎片情況，以及囊胚評級諸如囊胚擴張程度、內細胞團及滋養層的狀態等[1-7]；也可利用時差成像技術實時觀察胚胎的發育狀態，了解胚胎發育過程[8]，即將胚胎置于封閉穩定的環境下觀察并對其進行形態學評估[9]；進而制定胚胎移植方案。透明帶(zona pellucida,ZP) 硬度作為衡量胚胎質量的指標之一，是影響種植率和妊娠率的重要因素。臨床上主要通過激光輔助孵化技術來降低ZP硬度，改善臨床結局。ZP硬度與患者年齡關系密切，通常來自高齡患者的胚胎表面ZP硬度較大。然而，并非所有來自高齡患者的胚胎表面ZP硬度都異常增高，部分來自年輕患者的胚胎表面ZP硬度也有可能過高。由于臨床上缺乏評價胚胎表面硬度的物理參量，因此無法精準決策是否需要輔助孵化。

本研究自行設計了一種可模擬測量胚胎模型表面張力和ZP硬度的方法，通過該方法可以探究無創測量活胚胎表面張力的可能，報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料測量裝置包括分度值為0.1 g的電子秤，帶有壓縮刻度的鉆臺，自制的亞克力壓縮板，5 cm直徑充滿水的胚胎模型。整體示意圖見圖1。胚胎模型為橡膠氣球，充滿水后用手輕握懸空時接近球體，放置在地面上，在地心引力的作用下正視略偏橢圓，俯視為正圓。

1.2制作數據表制作胚胎模型壓縮數據表(表1)，包括壓縮距離I(mm)，秤讀數m(g)，作用力F(N)，實測壓縮部位半徑β壓(cm)，受力面積A壓(cm2)和接觸面壓強P壓(Pa)。

1.3測量步驟把鉆臺和亞克力壓縮板組裝好，放置好水槽，使壓縮版懸空于液面上；放松壓縮板的固定螺絲，手動調整，下壓壓縮板使其接觸水面，至其四周能同時接觸水面時旋緊固定螺絲并使壓縮版保持水平；撤去水槽，置電子秤于鉆臺底座上，秤上放置胚胎模型。

圖1 裝置整體示意圖

1.4胚胎模型表面壓強的計算以壓縮距離I為X，以壓強P壓為Y，擬合線性回歸模型，根據模型計算I=0時P壓。

1.5胚胎模型表面張力系數的計算推導拉普拉斯公式(式1)到合適的球面形式(式2)。把胚胎模型I=0時的半徑R和推算出的P壓同時代入式2，求出胚胎模型表面的張力系數γ壓=γ。

(1)

當球形胚胎模型未壓縮時半徑為R，即R1=R2=R，所以式1可以化簡為式2：

(2)

2 結果

2.1各指標實測結果見表1。

表1 自制壓力測量儀測量胚胎模型表面張力相關的參數值(n=3)

2.2胚胎模型未壓縮時的表面壓強根據表1數據擬合線性回歸模型，回歸方程為P壓=71.69I+1 558.4，見圖2。據此計算出，當I=0時，P壓=1 558.4 Pa。將P=1 558.4 Pa、R=0.025 m代入式4，得到γ壓=19.48 N/m。誤差線為P壓的正負標準差。

圖2 I和P壓的關系

3 討論

目前，細胞表面張力的測量方法均不適用于胚胎表面張力測量。離心技術可用于檢測細胞表面張力，其原理是：選用密度介于細胞核與細胞油脂之間的離心液；由于細胞內部油脂和細胞核在離心液中所受離心力不同而分布在細胞的兩級，把細胞拉伸成啞鈴狀，借助兩級的拉力差以及中間細部的周長，計算細胞表面張力。該方法使細胞過度拉長，過度的形變可造成細胞失活。另一種方法是使用比細胞直徑小的玻璃細管吹吸細胞使其形變，利用拉普拉斯原理求出張力系數[10]，但該技術要求細胞的表面張力恒定。震動液滴實驗也可用于測量細胞表面張力，其原理是：把細胞視為一個液滴，當細胞通過一個比其直徑細的微管而從另一端釋放時，細胞會來回震動，通過震動的時間周期和細胞質量推算其表面張力。該技術有一定難度且安全性較差。測量震動周期取決于微管直徑，直徑過大則細胞震動次數過少甚至不震動，直徑過小又會傷及細胞，細胞表面物質可能受損，因而永久變形。亦有研究[11]在細胞表面安裝分子探針，分子探針在細胞被拉伸和不被拉伸的情況下會發出不同波長的光，通過不同波長光強度的比判斷張力。此方法雖然可以進行精確測量，但是分子探針的載入改變了細胞表面化學物質，可能會對細胞活性造成影響。也有學者[12]對胚胎表面ZP進行定強激光照射，借助打穿時間對ZP硬度進行評估，但強激光照射可能會損傷胚胎。

本研究建立的測量方法，壓縮壓強關系圖符合正常彈性物體被壓縮的規律，即胚胎模型表面抵抗壓強隨著壓縮距離的增加而增加。該表面張力測量儀為直接測量儀器，在其壓縮胚胎模型時，得出的值經過電子秤微量測力，圖表統計軟件對散點圖的標定，在散點圖中規劃符合其排布的函數直線，沿趨勢判斷出圖中的縱軸截距，使用拉普拉斯公式利用截距和未壓縮時的半徑就可計算出張力值，技術操作簡便，產生誤差的操作少。

實驗中誤差的產生主要出現在秤讀數m和實測壓縮部位半徑β壓的取值。電子秤對于壓力的變化敏感，由于壓縮板的壓縮距離由人手工控制，所以m會有波動，造成圖2誤差線的增高。β壓取決于壓縮面直徑的測值。鉆臺上有刻度尺，最小分度值為1 mm，微小的偏差不可避免，對β壓讀數有整體性的影響，而小于1 mm的微動對于壓縮面直徑的影響就比較可觀。兩項偏差共同造成了圖2中的數據點不在一條平滑的線上。

本研究所設計的張力測量儀的測量方式是無損性的，胚胎模型只是被壓縮板進行簡單的物理性擠壓，沒有實質性的穿透損傷，也無需光學照射，可以減少因此造成的損傷，符合醫學中心原則，即降低風險、降低傷害、不產廢料，適用于臨床試驗。本裝置可以被微縮化處理：縮小亞克力壓縮板，縮小電子秤，增加微動裝置。經過縮微化處理后，把胚胎模型替換成實際的早期胚胎和使用顯微鏡觀察壓縮過程，就可以評估早期胚胎的ZP硬度，測值不大于限值可視為正常，大于限值可視為過硬。利用該裝置可以通過測定胚胎表面張力來預估ZP硬度，從而輔助臨床判斷胚胎質量。

致謝：李新建教授，鄭州大學物理學院，對文章中實驗方法的可行性給予了指導。