細胞治療中活體細胞體內示蹤分子影像技術研究進展

劉晶晶，王 燕，王辛宇，李曉天

1)鄭州大學藥學院 鄭州 450001 2)江蘇省原子醫(yī)學研究所分子影像中心 江蘇無錫 214063

細胞治療是指將正?；蚪涍^生物工程改造后的人體細胞輸入或移植到患者體內，以替代體內已受損細胞或者獲得更強的免疫殺傷能力，從而達到治療疾病的目的。按照細胞種類可分為干細胞治療和免疫細胞治療兩大類。其中干細胞治療廣泛用于癌癥、脊髓損傷、腦損傷以及神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等疾病的治療[1-4]；免疫細胞治療既可以單獨使用，也可以和其他療法(如化療等)結合用于癌癥的治療。癌癥免疫治療被《科學》雜志評為2013年度十大最佳科學突破之首[5]。截至2019年4月，F(xiàn)DA已批準免疫治療用于治療近20種癌癥如腦癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等[6]。

截至2019年，全球已有幾十種細胞治療產品獲批上市。為了確保細胞治療的安全性和有效性，加快其臨床轉化，需要對移植細胞的定位、存活等動態(tài)生物學行為進行非侵襲性縱向評估[7]。目前臨床上傳統(tǒng)監(jiān)測體內輸注細胞生物學行為的方法主要包括：血清中與T細胞活化相關的細胞因子分析、外周血中腫瘤特異性T細胞計數和腫瘤組織活檢[8]，但存在以下缺點：臨床上只能獲得血藥濃度數據；不能在活體內獲得多個時間點血藥濃度與組織分布數據；無法同時監(jiān)測人體各組織藥物暴露量；靶組織特異性差、創(chuàng)傷大等。傳統(tǒng)分析技術不能為臨床治療提供可靠的參考，難以滿足臨床需要。因此，加強對體內輸注細胞有效示蹤的研究，是解決細胞類藥物研發(fā)“瓶頸”的關鍵。迄今為止，尚無可用于活體細胞類藥物體內示蹤的標準化方法。

2017年12月22日，國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)發(fā)布的《細胞治療產品研究與評價技術指導原則(試行)》中指出，“細胞治療產品的分布及存續(xù)時間是影響細胞治療產品有效性和安全性的最重要因素，應進行動態(tài)觀察，必要時觀察至這些細胞的消失或功能喪失?？蛇x擇的技術方法有影像技術、PCR技術、免疫組化技術等。”影像技術已經被批準用于細胞類治療產品的體內藥代動力學研究。目前活體影像技術有很多，已提出可用于活體內細胞行為示蹤的成像技術主要包括生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging,BLI)、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、正電子發(fā)射斷層成像(positron emission tomography,PET)和單光子斷層顯像(single photon emission computed tomography,SPECT)等，這些技術已廣泛應用于細胞類藥物在乳腺癌、前列腺癌、神經系統(tǒng)疾病等多種模型的臨床前及臨床研究[9-12]。本文擬對常用影像監(jiān)測手段的優(yōu)缺點進行分析討論，并展望此類監(jiān)測方法的發(fā)展方向。

1 BLI

BLI即利用熒光素酶基因標記細胞或DNA，活體內注射熒光素后顯像，直接監(jiān)控體內的細胞活動或基因行為。BLI由熒光素酶催化、氧化其底物熒光素而發(fā)光，由于不需要外部光，具有較低的背景，使得生物發(fā)光標記物在體內易于識別監(jiān)測[13-14]。

長期以來，生物發(fā)光一直被用于追蹤組織和生物體中的細胞、基因表達以及其他生物學特征[15]。常用的熒光素酶主要有螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)luc)、海腎熒光素酶(renilla luciferase，Rluc)和高斯熒光素酶(gaussia luciferase，Gluc)等[16]。其中Fluc廣泛應用于臨床前小動物體內細胞類藥物監(jiān)測成像。2003年，Wang等[17]首次利用表達熒光素酶報告基因的慢病毒感染從造血干細胞中分離的CD34+細胞，使其穩(wěn)定表達熒光素酶，進而通過尾靜脈注射入NOD/SCID/β2mnull小鼠體內，采用BLI追蹤細胞在骨髓內的動態(tài)分布，結果發(fā)現(xiàn)移植細胞在脊柱、骨盆和股骨的信號最強，在顱骨和肱骨信號較低。BLI為追蹤人造血干細胞及祖細胞的體內移植動態(tài)行為提供了一種新的方法，揭示了人造血干細胞及祖細胞在活宿主骨髓空間中移植和增殖的動態(tài)信息。Steiner等[18]用表達Fluc的慢病毒構建感染CD34+臍帶血來源的造血干細胞，體外擴增后通過尾靜脈輸注入NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG)小鼠(預先用亞致死劑量照射)體內，通過BLI評估發(fā)現(xiàn)，體外擴增的臍帶血來源的干細胞可以產生持久的多系移植，幾乎與未擴增的臍帶血來源的干細胞相當。然而，BLI的靈敏度和空間分辨率均較低，無法檢測少量細胞；另外，活體組織對光的高吸收率和高散射性限制了光學信號的組織穿透力，以致只能檢測距離皮膚2～3 cm的深度。因此，這種淺表成像只能在實驗室的小動物研究中應用，臨床轉化價值較小。

總之，BLI顯像易于實施、成本低、無電離輻射，但由于空間分辨率較低，組織穿透力有限，目前僅限于在小動物體內示蹤轉染的腫瘤細胞和干細胞等[19-20]。BLI的臨床應用尚需要開發(fā)一些新的可用于人類的特異性分子探針[21]。

2 MRI

MRI是利用磁場可監(jiān)測原子核核磁共振的現(xiàn)象，使用計算機系統(tǒng)對人體各器官及不同生理狀態(tài)的組織進行成像的輔助診斷技術，具有無創(chuàng)、分辨率高、無輻射損傷等優(yōu)點，非常適用于活體細胞的體內示蹤[22]。自1992年首次報道運用超順磁性造影劑對大鼠中樞神經系統(tǒng)中移植的前體細胞進行示蹤以來，MRI已被用于監(jiān)測細胞類藥物在多種動物模型中的分布和遷移，特別是在心臟、肝臟和腦部等疾病模型中[23-24]。

細胞MRI標記物有兩大類：T1類陽性造影劑和T2類陰性造影劑。T1類主要有釓(Gd)、錳(Mn)，如Gd-DTPA(二乙三胺五醋酸釓)、Gd-DTPA-BMA(釓二胺)等，具有相對分子質量小、毒性低、順磁性強的特點，廣泛應用于腦部疾病的研究[25]。Gd3+是一種重金屬造影劑，造影增強的病變或標記的移植干細胞在T1加權像上表現(xiàn)為高強度，而在T2加權像上表現(xiàn)為低強度，因為基于Gd3+的造影可以縮短T1和T2的弛豫時間[26]。另一種造影劑為Mn2+,一方面，由于Mn2+具有與Ca2+相似的離子性質，可被腦和脊髓的興奮性細胞通過電壓門控Ca2+通道和Na+/Ca2+交換器而吸收，另一方面，Mn2+可以通過與特定蛋白質和核酸上的Ca2+和Mg2+結合位點結合而進入細胞，從而標記移植細胞的體內動力學行為。與陽性造影劑相比，陰性造影劑更為常用，主要有超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)、超小型超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)和微米大小的氧化鐵粒子(micron-sized particles of iron oxide,MPIOS)等[27]。Daldrup-Link等[28]用納米氧化鐵顆粒標記巨噬細胞，通過MRI監(jiān)測干細胞移植后的排斥反應。自2005年首次使用自體骨髓間充質干細胞(BMSC)治療腦卒中以來，相關臨床試驗也已廣泛開展。Shichinohe等[29]用SPIO標記BMSC進行了一項Ⅰ期臨床試驗，通過腦梗死區(qū)域立體定向給藥，使用MRI對細胞進行體內示蹤以評估BMSC用于急性缺血性卒中患者的安全性，結果證實SPIO-BMSC特異性地向病灶遷移，有助于臨床試驗選擇合適的給藥位置并闡明了治療機制。然而，用磁性造影劑標記細胞存在一些局限性，細胞標記會隨移植入體內細胞的增殖而被稀釋，導致監(jiān)測信號減少甚至丟失；此外，移植入體內的被標記細胞會被免疫細胞(如中樞神經系統(tǒng)的小膠質細胞)吞噬，造成磁性顆粒沉積，導致假陽性信號，甚至影響使用者的長期健康[30]。

簡言之，MRI用于活體細胞體內示蹤的優(yōu)點包括高分辨率、無電離輻射和三維解剖成像能力；缺點包括本底較高，定量難度大，以及無法監(jiān)測細胞的存活、增殖、分化等情況。

3 核醫(yī)學成像

核醫(yī)學成像又稱放射性核素成像(radio nuclear imaging,RNI)，圖像信號反映放射性核素的分布，主要包括PET和SPECT兩種成像方式。與MRI相比，核醫(yī)學成像具有更高的靈敏度。

SPECT顯像以發(fā)射單光子的放射性核素為探測對象，臨床上主要用于腫瘤學和神經病學等疾病的診斷、治療。用于活體細胞體內示蹤的探針主要由兩種放射性核素標記：111In和99mTc[31]。111In半衰期為2.8 d，在金屬離子載體8-羥基喹啉存在的情況下與待測細胞體外孵育即可實現(xiàn)細胞標記，通過SPECT對標記細胞進行5 ～ 7 d的連續(xù)監(jiān)測，已被FDA批準用于臨床各類細胞示蹤[32]。但這種標記是可逆的，標記細胞的穩(wěn)定性不佳，放射性核素易從標記部位解離，造成假陽性信號。另一種核素標記99mTc，半衰期較短(6 h)，不能用于長期示蹤。此外，從細胞解離、流出胞外的99mTc也會產生假陽性信號。

與SPECT相比，PET顯像具有更高的靈敏度和分辨率。PET顯像以正電子核素在湮沒時發(fā)射出的雙光子為探測對象。利用正電子核素標記的葡萄糖、小分子藥物、肽段或納米材料等作為分子探針，從分子水平上反映組織的生理、病理、生化、代謝等功能性變化和體內受體的分布情況，是臨床前和臨床研究中活細胞體內示蹤的一種獨特而重要的工具[11,33]。

臨床上常用的PET顯像的放射性核素主要有：89Zr(半衰期78.4 h)、18F(半衰期109.8 min)、68Ga(半衰期68.1 min)[34-35]等。常用的標記方法是對待測細胞進行直接標記，短半衰期的核素限制了可監(jiān)測時間，適用于細胞初始分布的短期監(jiān)測，不適合對細胞的分布、歸巢、增殖等長期行為進行評估。89Zr半衰期為78.4 h，具有相對低的正電子能量(395.5 keV)，適合標記生物半衰期較長的藥物載體(如納米類藥物、抗體等)，可對標記藥物進行2～3周的監(jiān)測。近年來，利用89Zr核素標記細胞的臨床前研究已有諸多報道[36-38]。Lee等[39]用89Zr-p-異硫氰酸苯甲酰去鐵氧胺(Df-Bz-NCS，DFO)對嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)進行直接標記，通過PET監(jiān)測細胞體內轉運情況。在注射標記細胞后，成功檢測到標記的CAR-T在肺部、肝臟以及脾臟的轉移，表明利用89Zr-DFO直接標記的PET成像技術可用于活體細胞體內示蹤。直接標記簡單且較易操作，適用于細胞初始分布的短期研究，其長期示蹤潛力會受到以下因素的影響：放射性核素的衰變、細胞分裂導致的標記稀釋、放射性核素離開細胞時的非特異性攝取以及細胞死亡后標記的持久存在等。

報告基因為活體細胞體內示蹤提供了另一種方法，可以對細胞的分布、遷移(歸巢)、增殖、存活進行更精確的監(jiān)測。已報道的PET顯像報告基因主要有：單純皰疹病毒1型胸苷激酶、前列腺特異性膜抗原(prostrate specific membrane antigen,PSMA)、多巴胺D2受體、生長抑素受體亞型2、人鈉/碘轉運體等，現(xiàn)已有很多相關研究[8,40]。Minn等[41]對CD19 CAR-T用PSMA(一種正常組織表達受限的人類蛋白)進行轉染，然后將其注入NSG小鼠急性淋巴細胞白血病模型進行治療，用[18F]DCFPyL對CD19 CAR-T進行標記，通過PET與BLI監(jiān)測CAR-T的體內行為。PET顯像結果顯示注射CAR-T治療后的第5天，骨髓轉移病灶處有放射性濃聚，表明有CAR-T浸潤；治療后的第11天， 細胞明顯浸潤在腫瘤原發(fā)病灶。BLI顯像表明治療后原發(fā)腫瘤灶內腫瘤細胞數量明顯減少，直至消失。上述研究表明可以使用PSMA-[18F]DCFPyL的PET顯像對CAR-T體內分布、增殖等生物學行為進行長期動態(tài)監(jiān)測。

除臨床前研究外，核醫(yī)學成像用于細胞治療的臨床研究也廣泛開展，如其在卵巢癌、結腸癌、多發(fā)性膠質母細胞瘤等癌癥的研究。為評估基因修飾的自體干細胞治療轉移性卵巢癌的安全性，Kershaw等[42]進行了一項Ⅰ期臨床試驗，這是第一篇用基因重組T細胞治療人卵巢癌的文章，研究中用111In-oxine標記治療性T細胞，采用核醫(yī)學成像對活體細胞進行體內示蹤，結果顯示T細胞最初在肺部集聚，隨后轉移至肝和脾，然而在腫瘤部位未見濃聚，這也與患者臨床反應較差一致。盡管基因重組T細胞未獲得較好的臨床療效，但該研究提示活體細胞體內示蹤技術對臨床方案的指導具有重要意義。

綜上所述，核醫(yī)學成像具有較理想的靈敏度、分辨率和穿透性，是活體細胞體內示蹤的理想方式，但需要放射性核素，儀器成本較高，同時對于特定監(jiān)測對象需要開發(fā)特異性的分子探針。

4 多模態(tài)成像

常用活體顯像技術特點對比見表1。

表1 常用活體顯像技術對比表

分子影像技術在活體細胞體內示蹤方面各有優(yōu)缺點，利用單一成像技術對活體細胞進行體內示蹤存在如下挑戰(zhàn)：標記效率較低；細胞增殖導致顯像探針稀釋或丟失；細胞死亡導致特異性差；吞噬作用造成信號監(jiān)測誤差；標記物脫靶的潛在副作用等。因此，開發(fā)新的多功能探針，使用多模態(tài)成像技術，可以提供更多信息。Lim等[1]開發(fā)了一種雙環(huán)[6.1.0]壬炔-共軛乙二醇殼聚糖納米粒(BCN-NP)作為雙模干細胞成像探針的遞送系統(tǒng)，對人脂肪來源的間充質干細胞進行生物正交標記，在光照血栓中風模型小鼠上應用NIRF/T2加權磁共振雙模成像技術對標記的間充質干細胞進行了14 d的有效追蹤。此外，Tang等[43]用125I標記熒光二氧化硅涂層SPIO，合成了一種具有MRI/SPECT/熒光3種顯像功能的分子探針，成功定量地追蹤到了靜脈注射的間充質干細胞在缺血性腦卒中大鼠模型體內的遷移和生物分布。

5 展望

建立高靈敏度、高特異性的定量分析方法是對活體細胞體內生物學行為示蹤的關鍵。將多個檢測探針結合到一個分子中可以提供互補的成像信息，多模態(tài)成像特異性分子探針因可綜合多種顯像方式的優(yōu)點，受到研究者的關注。靶向多模態(tài)成像和理論方法正逐漸成為研究熱點，其能為活體細胞體內示蹤提供活體、無創(chuàng)、定量、精確、特異性、縱向的監(jiān)測手段。目前有關多模態(tài)成像用于活體細胞體內示蹤的研究越來越多，多模態(tài)成像及特異性分子探針的研發(fā)將是未來的研究方向。