Bex2對膠質瘤細胞自噬及對替莫唑胺敏感性的影響

王華民，甄英偉，閆東明，齊平建，董虹廷

1)南陽市中心醫院神經外科 河南南陽 473000 2)鄭州大學第一附屬醫院神經外科 鄭州 450052

膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，起源于大腦或脊髓膠質細胞，具有較強的侵襲性，復發率高[1]。盡管目前有包括手術切除、化學療法和放射療法在內的治療策略，但膠質瘤患者的預后仍較差，3%～5%的患者在診斷后僅具有5 a的生存時間;長期化療會使患者形成化療抵抗,從而使化療療效下降[2-3]。因此，基因靶向治療有可能成為膠質瘤治療的一條新途徑。

Bex(brain expressed X-linked gene)家族成員在嗅覺受體神經元分化及功能研究中發揮了重要作用，可作為嗅覺標記蛋白；Bex3可通過調控神經生長因子的表達，介導神經細胞的凋亡[4-5]。Bex2作為Bex家族的成員之一，參與了神經系統發育調控和神經系統疾病的發生發展[6]。Bex2過表達可促進膠質瘤細胞LN-229的生長，而下調Bex2表達可使LN-229細胞對p53誘導的細胞凋亡更為敏感[7]。本研究利用siRNA技術下調人腦膠質瘤U87 MG細胞中Bex2的表達，探討下調Bex2表達對細胞自噬及對替莫唑胺(temozolomide,TMZ)敏感性的影響，以期為膠質瘤的綜合治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器胎牛血清、青霉素、鏈霉素、RPMI 1640培養液及胰蛋白酶購自美國HyClone公司。TMZ購于江蘇天士力帝益藥業有限公司(批號20160620)。Lipofectamine2000購自美國 Invitrogen 公司，靶向Bex2的siRNA(siRNA-Bex2)及陰性對照siRNA(siRNA-NC)由上海生工生物工程有限公司設計合成，mRFP-GFP-LC3質粒購自上海百致生物有限公司。Trizol試劑盒、cDNA合成試劑盒與SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。免疫組化染色、免疫熒光染色試劑和CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白測定試劑盒與化學發光液ECL購自北京索萊寶科技有限公司，Bex2、Beclin1、P62、自噬微管相關蛋白3(LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR抗體購自美國Santa Cruz Biotech 公司，鼠抗GAPDH與HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2人腦膠質瘤組織中Bex2蛋白表達的檢測采用免疫組化法檢測。待測標本來自南陽市中心醫院手術切除的15例腦膠質瘤患者，包括癌組織與癌旁正常組織(距癌組織≥2 cm)，患者術前均未接受化療、放療等輔助治療。患者及家屬均簽署知情同意書。本研究獲得南陽市中心醫院倫理委員會批準。將癌及癌旁正常組織用體積分數10%中性甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋，4 μm厚切片。切片經脫蠟處理，采用檸檬酸緩沖液高溫高壓修復抗原，加入體積分數3%H2O2室溫孵育10 min。滴加山羊血清室溫封閉20 min。加入一抗Bex2抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)37 ℃孵育 60 min。PBS沖洗后，DAB顯色，蘇木精復染，經乙醇梯度脫水、透明后，晾干，中性樹膠封片，光學顯微鏡采集圖像。Bex2陽性信號為棕色至棕褐色染色。隨機選擇5個100倍視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞占細胞總數的百分比，取5個視野的平均值。陽性細胞百分比<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。未著色為0分，棕色著色為1分，棕褐色著色為2分。兩項評分相加<2分則判定為陰性，≥2分判定為陽性。

1.3下調U87MG細胞中Bex2表達對細胞增殖及自噬相關蛋白表達的影響

1.3.1 細胞分組與轉染 U87 MG細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，用含體積分數10%胎牛血清、10 g/L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。待細胞融合度達到80%以上時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。將細胞分為3組處理：空白對照組正常培養不進行轉染,siRNA-NC組轉染siRNA-NC， siRNA-Bex2組轉染 siRNA-Bex2。按照Lipofectamine2000說明書操作，進行轉染。

1.3.2 細胞中Bex2 mRNA的檢測 采用qRT-PCR法。轉染48 h后分別收集3組細胞，Trizol法提取總RNA，Nanodrop測定提取的RNA純度和濃度，按照cDNA合成試劑盒說明進行反轉錄獲得cDNA。按照SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明進行PCR，以β-actin為內參。擴增程序為：95 ℃預變性5 min(1個循環)；95 ℃變性30 s， 55 ℃退火15 s， 72 ℃延伸30 s(40個循環)。采用2-ΔΔCt法計算Bex2 mRNA的相對表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成。Bex2上游引物:5’-AGCCTAATAGTCCGATTGC-3’，下游引物:5’-TGGCATTAGCAGTAGGCT-3’；β-actin上游引物:5’-CCCTGGCACCCAGCACGCTTC-3’，下游引物:5’-GCCGATCCACACGGAGTAC-3’。

1.3.3 細胞中Bex2及自噬相關蛋白的檢測 采用Western blot法。轉染48 h后分別收集3組細胞，用RIPA裂解緩沖液進行裂解，4 ℃下13 000×g離心15 min，使用Bradford試劑盒檢測上清中蛋白質濃度。取50 μg蛋白上樣行SDS-PAGE，分離蛋白后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，在50 g/L脫脂奶粉溶液中封閉2 h。滴加一抗4 ℃下孵育過夜，一抗分別為Bex2(1∶150)、LC3-Ⅰ(1∶200)、LC3-Ⅱ(1∶200)、Beclin1(1∶200)、P62(1∶200)抗體。TBST清洗，滴加HRP標記的水平抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發光液顯色曝光，凝膠成像系統拍照。采用Image-Pro Plus軟件分析，以GAPDH作為內參，目的蛋白表達水平為目的條帶與內參條帶灰度值的比值。

1.3.4 細胞增殖抑制率的檢測 將對數生長期的U87 MG細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養24 h后，按照1.3.1分組處理，每組設置6個復孔。于轉染后24、48、72 h，每孔滴加10 μL的CCK-8溶液，繼續培養4 h，以酶標儀于450 nm處讀取吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A/對照A)×100%。

1.3.5 細胞對TMZ敏感性的檢測 將對數生長期的U87 MG細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養24 h后，按照1.3.1分組處理，每組設置6個復孔。轉染48 h后，更換為含不同濃度(0、25、50、100、200 μmol/L)TMZ的培養基繼續培養48 h，然后CCK-8法檢測細胞增殖抑制率。

1.4下調Bex2和TMZ處理對U87MG細胞自噬及相關蛋白表達的影響

1.4.1 實驗分組 將對數生長期的U87 MG細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養24 h后，分4組處理。siRNA-NC組轉染siRNA-NC 48 h；siRNA-NC+TMZ組轉染siRNA-NC 48 h后使用100 μmol/L TMZ處理48 h；siRNA-Bex2組轉染siRNA-Bex2 48 h；siRNA-Bex2+TMZ組轉染siRNA-Bex2 48 h后使用100 μmol/L TMZ處理48 h。

1.4.2 細胞自噬的觀察 將對數生長期的U87 MG細胞以 1×104個/孔鋪于24孔板的無菌玻片上，24 h后將10 μL mRFP-GFP-LC3質粒轉染到U87 MG細胞中，孵育2 h后再按1.4.1分組處理。收集細胞，PBS洗滌，中性樹膠封片，于熒光顯微鏡下觀察細胞自噬情況。mRFP和GFP重疊的黃色熒光表示自噬體，mRFP紅色熒光表示自噬溶酶體。

1.4.3 細胞中AMPK/mTOR信號通路蛋白及自噬相關蛋白的檢測 采用Western blot法，具體操作參考1.3.3。檢測的自噬相關蛋白有Beclin1(1∶200)、P62(1∶200)、LC3-Ⅰ(1∶200)、LC3-Ⅱ(1∶200)，AMPK/mTOR信號通路蛋白有p-AMPK(1∶500)、AMPK(1∶1000)、p-mTOR(1∶500)、mTOR(1∶1 000)。

1.5統計學處理使用SPSS 20.0進行數據分析。腦膠質瘤組織及癌旁正常組織中Bex2蛋白表達的比較采用校正McNemar檢驗；3組細胞中Bex2 mRNA和蛋白表達水平，細胞增殖抑制率，LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗；4組細胞中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白表達水平的比較采用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1腦膠質瘤組織中Bex2蛋白的表達見圖1、表1。人腦膠質瘤組織中Bex2陽性表達率為93.33%(14/15)，高于癌旁正常組織(13.33%，2/15)。

圖1 腦膠質瘤癌旁正常(A)和癌(B)組織中Bex2的表達(免疫組化，×100)

表1 膠質瘤和癌旁正常組織中Bex2蛋白表達的比較 例

χ2=10.083，P<0.001

2.2下調Bex2表達后U87MG細胞中Bex2mRNA和蛋白的表達見圖2、表2。與空白對照組和siRNA-NC組比較，siRNA-Bex2組細胞中Bex2 mRNA和蛋白的表達降低。

1：空白對照組；2：siRNA-NC組；3：siRNA-Bex2組

表2 3組細胞中Bex2 mRNA和蛋白表達的比較(n=6)

2.3下調Bex2表達后U87MG細胞自噬水平的變化見圖3、表3。與空白對照組和siRNA-NC 組比較，siRNA-Bex2組細胞中LC3-Ⅱ和 Beclin1蛋白表達水平降低， P62蛋白表達水平升高。

1：空白對照組；2：siRNA-NC組；3：siRNA-Bex2組

表3 3組細胞中自噬相關蛋白表達的比較(n=6)

2.4下調Bex2表達后U87MG細胞增殖抑制率的變化3組細胞增殖抑制率的比較見表4。轉染后 24、48和72 h，siRNA-Bex2組細胞增殖抑制率均高于空白對照組和siRNA-NC 組。

表4 3組細胞增殖抑制率的比較(n=6) %

2.5下調Bex2表達后U87MG細胞對TMZ敏感性的變化不同濃度TMZ作用48 h后3組細胞增殖抑制率檢測結果見表5。隨TMZ濃度的增加，3組細胞增殖抑制率均升高；siRNA-Bex2組增殖抑制率高于空白對照組與siRNA-NC 組。100 μmol/L的TMZ作用于siRNA-Bex2組U87 MG細胞48 h后，細胞增殖抑制率可達56.46%。

表5 不同濃度TMZ作用48 h后3組細胞增殖抑制率的比較(n=6) %

2.6下調Bex2表達和TMZ處理對U87MG細胞自噬水平的影響與siRNA-NC+TMZ組和siRNA-Bex2組比較，siRNA-Bex2+TMZ組U87 MG細胞熒光強度下降(圖4)，說明細胞自噬水平降低。自噬相關蛋白表達水平測定結果見圖5與表6。siRNA-Bex2和TMZ處理均可降低細胞中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達水平，升高LC3-Ⅰ和P62蛋白表達水平。

上：siRNA-NC組；中上：siRNA-NC+TMZ組；中下：siRNA-Bex2組；下：siRNA-Bex2+TMZ組

1：siRNA-NC組；2：siRNA-NC+TMZ組；3：siRNA-Bex2組；4：siRNA-Bex2+TMZ組

表6 4組細胞中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1及P62蛋白表達的比較(n=6)

2.7下調Bex2表達和TMZ處理對U87MG細胞AMPK/mTOR信號通路蛋白表達的影響見圖6、表7。siRNA-Bex2和TMZ均可使細胞中AMPK 磷酸化水平下降，mTOR磷酸化水平升高。

1：siRNA-NC組；2：siRNA-NC+TMZ組；3：siRNA-Bex2組；4：siRNA-Bex2+TMZ組

表7 4組細胞中p-AMPK、AMPK、p-mTOR及mTOR蛋白表達的比較(n=6)

3 討論

化學療法是膠質瘤術后的輔助療法之一。目前，用于膠質瘤的化療藥物主要有TMZ、順鉑、甲氨蝶呤等。TMZ是一線化療藥物，但膠質瘤細胞化療耐藥性的產生削弱了其臨床療效[8]。因此，探索膠質瘤的治療靶點和TMZ作用的分子機制將有助于提高膠質瘤化療的療效。

細胞自噬是真核細胞應對不良外部刺激的應激反應，是由溶酶體介導的一種高度保守的過程，可通過降解錯誤折疊的蛋白質、受損的細胞器以及其他異物來維持細胞的動態平衡[9]。自噬不僅參與維持細胞的生理穩態調節，還與癌癥的發生發展、化療敏感性等密切相關[10-11]。研究表明，化療藥物作用后骨肉瘤細胞的自噬被激活，之后細胞對化療的敏感性降低[12]；耐藥的食管癌細胞自噬水平升高，抑制自噬可增強食管癌細胞對化療的敏感性[13]。LC3不僅對自噬小體的形成至關重要，而且在自噬的進展中也具有關鍵意義[14]，可作為自噬的標志物。

本研究結果顯示，人腦膠質瘤組織中Bex2 蛋白表達水平升高。轉染siRNA-Bex2的U87 MG細胞中Bex2 mRNA和蛋白的表達水平均降低，說明Bex2表達受到抑制。轉染siRNA-Bex2后U87 MG細胞的增殖抑制率升高，對TMZ的敏感性也增強；LC3-Ⅱ和 Beclin1蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高，說明降低Bex2表達可以降低U87 MG細胞的自噬水平，提高其對TMZ的敏感性。轉染 siRNA-Bex2后再經過TMZ處理的U87 MG細胞中LC3-Ⅱ和 Beclin1蛋白表達水平降低，而LC3-Ⅰ和P62蛋白表達水平升高；提示抑制Bex2表達和TMZ處理可有效抑制U87 MG細胞自噬的發生。

眾所周知，自噬由復雜的網絡機制所調節。其中，AMPK/mTOR信號通路參與了自噬過程?；罨膍TOR可通過調控自噬相關基因13(ATG13)抑制自噬，而 AMPK的活化可直接抑制mTOR磷酸化水平，從而促進自噬的發生[15]。在本研究中，siRNA-Bex2和TMZ處理的U87 MG細胞中AMPK磷酸化水平下降，而mTOR磷酸化水平升高，提示siRNA-Bex2和TMZ可能通過調節AMPK/mTOR信號通路，調節細胞的自噬。

綜上所述，應用RNA干擾技術抑制膠質瘤細胞中Bex2的表達可阻礙細胞的增殖，抑制自噬，提高細胞對化療的敏感性，這為臨床治療膠質瘤提供了新的思路及實驗依據。