黃芪多糖對裸鼠結直腸癌移植瘤的抑制作用

趙媛媛，張 楠，孫維義，郅 強

1)河南中醫藥大學 鄭州 450000 2)河南中醫藥大學第一附屬醫院微創腔鏡外科 鄭州 450046

結直腸癌是最常見的消化系統惡性腫瘤，危及人們健康和生命安全，在我國發病率和死亡率逐年上升[1]。結直腸癌的治療包括手術、化療、中醫藥治療等。黃芪多糖是豆科植物黃芪的主要活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性，尤其是多重抗腫瘤活性作用備受關注[2]。有研究[3-4]報道，黃芪多糖可以通過誘導腫瘤細胞凋亡、調節免疫狀態、抑制新生血管形成、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移等多種機制發揮廣譜抗腫瘤作用。結直腸癌的生長與多種炎性因子關系密切，其中白介素17(interleukin-17，IL-17)參與炎癥反應和免疫反應，在結直腸癌患者血清中高表達，促進結直腸癌的發生發展[5]。IL-17主要由Th17細胞產生，在轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)和IL-6共同誘導下，通過TGF-β1信號轉導和轉錄激活因子3及干擾素調節因子4，調節誘導CD4+T細胞向Th17細胞分化[6-7]。結直腸癌組織中TGF-β1含量升高與結直腸癌惡性程度、增殖及侵襲轉移能力密切相關[8]。目前有研究表明黃芪多糖能夠體外抑制結直腸癌HCT-116細胞侵襲和遷移[3]，體外抑制結直腸癌HT-29細胞增殖[9]。然而，黃芪多糖在體內抗結直腸癌活性及其具體抗腫瘤機制尚不清楚。本研究擬探討黃芪多糖對BALB/C裸鼠結直腸癌移植瘤生長的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞、動物和主要材料HCT-116細胞由山東大學病理實驗室提供；SPF級雄性BALB/C nu/nu裸鼠購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場，實驗動物合格證號SCXK(豫)2019-0002。RPMI 1640培養基、胰蛋白酶細胞消化液、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液均購自Biosharp公司，PBS購自HyClone。注射用黃芪多糖購自天津賽諾制藥有限公司，氟尿嘧啶注射液購自上海旭東海普藥業有限公司，生理鹽水注射液購自河南科倫藥業有限公司。小鼠血清IL-17和TGF-β1 ELISA試劑盒購自CUSABIO公司，HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2HCT-116細胞培養及結直腸癌移植瘤模型的建立HCT-116細胞用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，生長至約90%融合時進行傳代或凍存，取3代后的細胞用于后續實驗。

收集處于對數生長期的HCT-116細胞，用無血清RPMI 1640培養基重懸制備細胞懸液，調整細胞密度為1×107個/mL。用1 mL注射器吸取0.2 mL細胞懸液注射至BALB/C裸鼠腋下稍偏背側。接種腫瘤細胞后，觀察裸鼠飲食、精神和活動狀態。

1.3實驗動物分組及處理接種第10天，將接種部位皮下結節體積大于62.5 mm3的裸鼠按照隨機數字表法分為3組：模型對照組、黃芪多糖組和氟尿嘧啶組，每組10只。模型對照組腹腔注射生理鹽水(20 mL/kg)，1次/d，連續21 d；黃芪多糖組給予黃芪多糖(250 mg/kg)，腹腔注射，1次/d，連續21 d；氟尿嘧啶組給予氟尿嘧啶(200 mg/kg)，腹腔注射，1次/周，連續3周。

1.4觀察指標

1.4.1 裸鼠體重及瘤體體積測量 實驗期間用電子天平稱量裸鼠體重，游標卡尺測量移植瘤長徑(a)、短徑(b)，按照體積公式V=1/2(ab2)計算移植瘤體積，造模后每3 d測量1次。

1.4.2 血清IL-17、TGF-β1水平的ELISA法檢測 給藥21 d后，裸鼠用體積分數4%水合氯醛麻醉，心臟取血，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取血清備用。參照ELISA檢測試劑盒說明書操作步驟，檢測血清TGF-β1、IL-17水平。

1.4.3 裸鼠瘤體、肝臟的病理學表現 分離裸鼠皮下移植瘤瘤體及肝尾狀葉，40 g/L多聚甲醛固定，經石蠟包埋、切片(4 μm厚)、HE染色后，于光學顯微鏡下觀察組織形態結構。

1.5統計學處理采用SPSS 22.0進行數據分析，應用重復測量數據的方差分析比較各組裸鼠移植瘤瘤體生長情況；應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較3組裸鼠血清IL-17與TGF-β1水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組裸鼠一般情況及體重變化情況接種后4～7 d開始長出瘤體，30只BALB/C裸鼠均荷瘤成功，早期飲食、體重、精神狀態、活動度等情況沒有明顯改變。隨著荷瘤生存時間延長以及藥物干預，荷瘤裸鼠體重降低，個別裸鼠出現腹瀉；荷瘤期間黃芪多糖組、氟尿嘧啶組各死亡1只。氟尿嘧啶組裸鼠在給藥后出現食欲減退、精神活動差、皮膚粗糙、消瘦和體重減輕現象；與氟尿嘧啶組相比，黃芪多糖組裸鼠體重減輕不明顯。

2.2各組裸鼠移植瘤瘤體生長變化情況在給藥1周后黃芪多糖組瘤體體積明顯低于模型對照組(P<0.05)；黃芪多糖組與氟尿嘧啶組比較，瘤體體積差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組裸鼠移植瘤瘤體體積比較 mm3

2.3各組腫瘤組織及肝臟組織病理學變化藥物干預21 d經麻醉后剝離腫瘤標本，瘤體邊界清晰、不規則、質硬，與周圍組織粘連致密，剝離后可見完整被膜包被，呈淡粉色。模型對照組腫瘤組織增生、血管增生和細胞異型性明顯，腫瘤細胞形狀排列不規則，細胞體積偏大(圖2A1)；肝尾狀葉可見多個散在結節，組織結構紊亂，肝小葉結構破壞，有核大、深染的團狀癌組織分布(圖2A2、3)。與模型對照組比較，黃芪多糖組腫瘤組織異型性不明顯，血管增生少，腫瘤細胞體積小(圖2B1)，肝尾狀葉未見明顯結節、腫瘤轉移灶浸潤和肝細胞損害(圖2B2、3)；氟尿嘧啶組腫瘤組織異型性、血管增生不明顯(圖2C1)，肝尾狀葉細胞腫脹、體積增大，局部可見炎性細胞浸潤現象(圖2C2、 3)。

A：模型對照組；B：黃芪多糖組；C：氟尿嘧啶組；1：移植瘤鏡下觀(×100)；2：肝尾狀葉大體觀；3：肝尾狀葉鏡下觀(×100)

2.4各組裸鼠血清IL-17與TGF-β1水平變化見表2。與模型對照組比較，黃芪多糖組血清IL-17與TGF-β1水平降低(P<0.05)；與氟尿嘧啶組比較，黃芪多糖組血清IL-17水平差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組裸鼠血清IL-17與TGF-β1水平比較

3 討論

黃芪多糖是豆科植物黃芪的主要活性成分，可以有效增強細胞活性，維持細胞的正常結構，降低肺癌患者外周循環髓源性抑制細胞水平，改善機體免疫功能[10]，還可以有效促進抗原遞呈的能力，發揮CD8+T細胞的功能，增強機體抑制腫瘤發生與進展的能力[11-12]，表現出多重抗腫瘤作用。

本實驗結果顯示，黃芪多糖治療后裸鼠體重降低不明顯，瘤體體積生長明顯低于模型對照組，腫瘤細胞增殖、侵襲和異型性不明顯，肝臟無明顯轉移灶，這與王旗等[3]干預體外培養人結直腸癌HCT-116細胞抑制腫瘤細胞侵襲和遷移結果一致。與氟尿嘧啶組比較，裸鼠體重減輕幅度小，且肝臟細胞無明顯損害。這些結果表明黃芪多糖可通過改善機體免疫應答、提高機體免疫功能發揮體內抗腫瘤作用。

腫瘤在體內生長不僅依賴于腫瘤細胞自身的生長，還與血管等其他因素密切相關。體內實驗影響因素廣泛，更能有效擬合真實世界，尤其是腫瘤對機體的整體影響，更能直觀觀察侵襲性轉移。IL-17可能通過局部炎癥導致腫瘤細胞生存、增殖，形成一個有利于腫瘤細胞生長的免疫微環境，并通過促進腫瘤血管的生成促進腫瘤的生長和轉移[13]。TGF-β1是血管生長的重要標志因子，通過激活腫瘤相關成纖維細胞促進腫瘤新生血管生成，促進腫瘤生長和轉移[14]。本研究結果顯示，與模型對照組相比，黃芪多糖治療后裸鼠血清IL-17和TGF-β1蛋白表達水平降低，這表明黃芪多糖可能通過抑制裸鼠體內IL-17和TGF-β1蛋白表達從而達到抗結直腸腫瘤生長和轉移的作用。

綜上所述，本研究結果表明，黃芪多糖是高效低毒的抗腫瘤藥物，并且抗腫瘤作用與TGF-β1和IL-17蛋白密切相關。這為下一步探索黃芪多糖對腫瘤生長轉移作用機制的研究提供了實驗基礎。