上調(diào)環(huán)狀RNA_8199表達(dá)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

王 偉， 燕迪迪，丁 爽，倪凱園，姜國(guó)忠

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

食管癌在全球癌癥發(fā)病率中排名第7，病死率排名第6[1]。我國(guó)90%以上的食管癌病例是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]。由于ESCC起病隱匿，多數(shù)患者診斷時(shí)已是晚期，預(yù)后很差。因此，明確ESCC發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制，探尋有效的生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)對(duì)于ESCC的早期診斷、精準(zhǔn)治療和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)意義重大。環(huán)狀RNA是一類(lèi)閉合成環(huán)的非編碼RNA，不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴[3]。目前的研究[4-6]表明環(huán)狀RNA參與了基因的翻譯調(diào)控并介導(dǎo)了多種腫瘤的進(jìn)展。如環(huán)狀RNA_0000263在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增加，環(huán)狀RNA_0000263/miR-150-5p/MDM4調(diào)控軸可能通過(guò)影響p53基因的表達(dá)在宮頸癌的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。環(huán)狀RNA_LDLRAD3在胰腺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá),下調(diào)其表達(dá)可以通過(guò)調(diào)控miR-137-3p/PTN軸抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[5]。環(huán)狀RNA_CDK13在肝癌細(xì)胞和組織中表達(dá)降低,上調(diào)環(huán)狀RNA_CDK13表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并改變細(xì)胞周期進(jìn)程[6]。本研究檢測(cè)了環(huán)狀RNA_8199在ESCC細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討上調(diào)環(huán)狀RNA_8199表達(dá)對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries公司，胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司，基因組DNA(gDNA)提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa公司，ABI7500熒光PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。RNase R購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。免疫熒光探針由上海吉瑪公司合成，雜交試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，核漿分離試劑盒購(gòu)自廣州博徠斯生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，CCK-8購(gòu)自日本同仁試劑公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coming公司。

1.2細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)人ESCC細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270、KYSE520、KYSE150、KYSE410購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.3RT-PCR檢測(cè)KYSE520細(xì)胞中環(huán)狀RNA_8199的表達(dá)Trizol法提取KYSE520細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用gDNA提取試劑盒提取KYSE520細(xì)胞gDNA，并將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA和gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用發(fā)散引物(上游引物5’-ATGTGGCCAATGGGTTTAAG-3’，下游引物5’-GCAAGCTCAACAGCATGAGA-3’)擴(kuò)增環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，使用聚合引物(上游引物5’-GAAACAGCAC CCAGGACTA-3’,下游引物5’-CTGATTGAATTCTG GTTCACAG-3’)擴(kuò)增線性轉(zhuǎn)錄本，GAPDH(上游引物5’-GAGTCCACTGGCGTCTTCA-3’，下游引物5’-TGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3’)作為內(nèi)參，引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司鄭州分公司合成。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，后置于凝膠成像儀上觀察，拍照記錄。

1.4Sanger測(cè)序鑒定環(huán)狀RNA_8199的環(huán)化剪接點(diǎn)序列從環(huán)狀RNA Base數(shù)據(jù)庫(kù)獲取環(huán)狀RNA_8199序列，據(jù)此設(shè)計(jì)一對(duì)引物以擴(kuò)增包含反向剪切位點(diǎn)的序列，上游引物5’-GCTTCAGGTGTCTTCG CAAT-3’，下游引物5’-AATCTTCATTCCGTGAG GCAAT-3’。以KYSE150和KYSE410細(xì)胞的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后，送河南尚亞生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序驗(yàn)證。

1.5環(huán)狀RNA_8199在KYSE520細(xì)胞中的特性表達(dá)Trizol法提取KYSE520細(xì)胞中總RNA，將提取的RNA分為RNase R處理組和對(duì)照組各10 μg。RNase R處理組用20 U RNase R處理(2 U/μg)，對(duì)照組用等量雙蒸水替代,于37 ℃孵育10 min。兩組分別取等量消化產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)環(huán)狀RNA_8199和ATXN10 mRNA的表達(dá)，選用 GAPDH 作為內(nèi)參。反應(yīng)體系共20 μL:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL,上、下游引物各0.8 μL,滅菌蒸餾水6 μL,cDNA 2 μL。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞免疫熒光法和核漿分離法檢測(cè)環(huán)狀RNA_8199在KYSE520和KYSE270細(xì)胞中的亞定位①將KYSE520和KYSE270細(xì)胞以每孔6×104個(gè)細(xì)胞分別接種于12孔板里，棄去培養(yǎng)基，PBS浸洗3次；每孔中加入1 mL 40 g/L多聚甲醛，室溫下固定15 min，PBS洗滌3次；加入體積分?jǐn)?shù)1%的Triton破膜15 min，用PBS洗滌3 次后加入體積分?jǐn)?shù)10%的山羊血清室溫下封閉1 h；除去山羊血清，加入探針對(duì)環(huán)狀RNA_8199序列的反向剪接區(qū)進(jìn)行熒光原位雜交，4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min；熒光顯微鏡下觀察及照相。②根據(jù)核漿分離試劑盒說(shuō)明對(duì)KYSE520和KYSE270細(xì)胞進(jìn)行核漿分離，細(xì)胞漿定位內(nèi)參為S14，細(xì)胞核定位內(nèi)參為U2。qRT-PCR法分別檢測(cè)細(xì)胞核、漿中環(huán)狀RNA_8199的表達(dá)，選用GAPDH作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組通過(guò)Lipofectamine 2000將高表達(dá)環(huán)狀RNA_8199的質(zhì)粒載體(環(huán)狀RNA_8199-OE)及陰性對(duì)照(環(huán)狀RNA_8199-NC)分別轉(zhuǎn)染到KYSE30和KYSE70細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)環(huán)狀RNA_8199對(duì)KYSE30、KYSE70細(xì)胞增殖能力的影響將轉(zhuǎn)染后的KYSE30、KYSE70細(xì)胞以每孔2×103個(gè)細(xì)胞分別接種于96孔板，培養(yǎng)24、48、72和96 h。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別向孔中加入 10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)環(huán)狀RNA_8199對(duì)KYSE30、KYSE70細(xì)胞克隆形成能力的影響將轉(zhuǎn)染后的KYSE30、 KYSE70細(xì)胞接種于6孔板中(每孔300個(gè)細(xì)胞)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)14 d，室溫下甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，沖洗并干燥后置于低倍鏡下觀察，含有50個(gè)細(xì)胞以上的集落視為一個(gè)克隆，計(jì)數(shù)克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)環(huán)狀RNA_8199對(duì)KYSE30細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的KYSE30細(xì)胞加入無(wú)血清培養(yǎng)基中重懸，得到的細(xì)胞懸液調(diào)整至密度為2×105個(gè)/mL，上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，同時(shí)將600 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640加入下室，培養(yǎng)24 h后取出，甲醛固定后用結(jié)晶紫溶液染色30 min，PBS沖洗，于100倍鏡下選取5個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：用 Matrigel基質(zhì)膠涂于上室，余實(shí)驗(yàn)步驟同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間OD值的比較采用2×4析因設(shè)計(jì)的方差分析;細(xì)胞漿和細(xì)胞核中環(huán)狀RNA_8199相對(duì)表達(dá)量,兩組間環(huán)狀RNA_8199和ATXN10 mRNA相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1KYSE520細(xì)胞中環(huán)狀RNA_8199的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本只能通過(guò)發(fā)散引物在cDNA中擴(kuò)增出來(lái)，而線性轉(zhuǎn)錄本可通過(guò)聚合引物同時(shí)在cDNA 和gDNA中擴(kuò)增出來(lái)。

M：Marker；內(nèi)向箭頭指聚合引物，外向箭頭指發(fā)散引物

2.2環(huán)狀RNA_8199環(huán)化剪接點(diǎn)序列的Sanger測(cè)序Sanger測(cè)序結(jié)果證實(shí)了環(huán)狀RNA_8199的環(huán)化剪接點(diǎn)序列，見(jiàn)圖2。

圖2 環(huán)狀RNA_8199環(huán)化剪接點(diǎn)序列的Sanger測(cè)序結(jié)果

2.3對(duì)照組與RNaseR處理組環(huán)狀RNA_8199、ATXN10mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較結(jié)果見(jiàn)表1。RNase R處理后環(huán)狀RNA_8199對(duì)應(yīng)的線性轉(zhuǎn)錄物ATXN10 mRNA表達(dá)水平下降，環(huán)狀RNA_8199的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平無(wú)改變。

表1 兩組環(huán)狀RNA_8199、ATXN10 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較(n=3)

2.4KYSE520和KYSE270細(xì)胞中環(huán)狀RNA_8199的亞定位環(huán)狀RNA_8199主要定位于細(xì)胞漿中，見(jiàn)圖3。核漿分離實(shí)驗(yàn)顯示，KYSE520和KYSE270細(xì)胞中環(huán)狀RNA_8199在細(xì)胞漿水平高于細(xì)胞核水平，見(jiàn)表2。

圖3 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)KYSE520和KYSE270細(xì)胞中環(huán)狀RNA_8199亞定位結(jié)果(×200)

表2 KYSE520和KYSE270細(xì)胞漿和細(xì)胞核中環(huán)狀RNA_8199表達(dá)水平的比較(n=3)

2.5上調(diào)環(huán)狀RNA_8199表達(dá)對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響結(jié)果見(jiàn)表3、4。與環(huán)狀RNA_8199-NC組相比，環(huán)狀RNA_8199-OE組ESCC細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均下降。

表3 兩組KYSE30、KYSE70細(xì)胞OD值比較(n=3)

表4 兩組ESCC細(xì)胞克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)比較(n=3)

3 討論

食管癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)2017年全球新增食管癌病例約為47萬(wàn)[2]。由于食管癌起病隱匿且侵襲性強(qiáng)，多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期，5 a生存率不足20%[7]。因此，我們迫切需要進(jìn)一步研究ESCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探尋有效的生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)。

環(huán)狀RNA是一類(lèi)表達(dá)穩(wěn)定且進(jìn)化保守的非編碼RNA，自身或其調(diào)控通路的紊亂可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。大多數(shù)環(huán)狀RNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中的miRNA和蛋白相互作用共同發(fā)揮調(diào)控功能[8]。證據(jù)表明環(huán)狀RNA在多種腫瘤中表達(dá)異常。如環(huán)狀RNA_FGFR1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)海綿吸附作用與miR-381-3p共同導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展和免疫逃避的發(fā)生[9]。環(huán)狀RNA_LONP2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-17的成熟來(lái)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[10]。環(huán)狀RNA_MBOAT2在前列腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)環(huán)狀RNA_MBOAT2可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。

文獻(xiàn)[12-14]證實(shí)環(huán)狀RNA可以調(diào)控ESCC的進(jìn)展并影響其預(yù)后，具有成為ESCC預(yù)測(cè)因子和治療靶點(diǎn)的潛力。環(huán)狀RNA_0004771在ESCC患者血漿和組織中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)調(diào)控miR-339-5p/CDC25A促進(jìn)ESCC進(jìn)展[12]。環(huán)狀RNA_LARP4在ESCC細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)環(huán)狀RNA_LARP4可以抑制ESCC細(xì)胞增殖和遷移并促進(jìn)凋亡[13]。環(huán)狀RNA_0012563在ESCC中表達(dá)顯著上調(diào),敲低環(huán)狀RNA_0012563可以抑制XRCC1介導(dǎo)的EMT通路，從而抑制ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力[14]。

本研究首先采用RT-PCR法檢測(cè)了KYSE520細(xì)胞中環(huán)狀RNA_8199的表達(dá)情況，并進(jìn)一步采用Sanger測(cè)序法鑒定了其環(huán)化剪接位點(diǎn)。環(huán)狀RNA的閉合成環(huán)結(jié)構(gòu)使其與線性RNA相比，表達(dá)水平更加穩(wěn)定[15]。通過(guò)RNase R實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RNase R處理后環(huán)狀RNA_8199的表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變，而ATXN10 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯下降，證明了環(huán)狀RNA_8199相比于線性轉(zhuǎn)錄本更能抵抗RNase R消化作用。細(xì)胞免疫熒光和核漿分離實(shí)驗(yàn)證明了環(huán)狀RNA_8199主要存在于細(xì)胞漿中。另外，本研究還探索了環(huán)狀RNA_8199對(duì)ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。我們構(gòu)建了高表達(dá)環(huán)狀RNA_8199質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ESCC細(xì)胞中環(huán)狀RNA_8199表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性明顯降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少，侵襲與遷移能力明顯受到抑制。這表明環(huán)狀RNA_8199參與并影響了ESCC的發(fā)生發(fā)展，因此，有望成為ESCC基因治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA_8199與ESCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示環(huán)狀RNA_8199可能是食管癌診療的有效靶點(diǎn)之一。然而我們的研究仍有一定的局限性，如環(huán)狀RNA_8199抑制ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的具體作用機(jī)制尚不清楚，因此，還需進(jìn)一步探索環(huán)狀RNA_8199發(fā)揮各種生物學(xué)功能的具體機(jī)制。