狂犬病新型基因工程疫苗研究進展

柴本杰，黃菲，裴捷，周明，田大勇2，傅振芳，趙凌

1.華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室/華中農業大學動物醫學院，武漢 430070；2.上海青賽生物科技有限公司，上海 201506

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)感染引起的一種高度致死性的人獸共患傳染病。RABV共編碼5個結構蛋白，分別是核蛋白(nucleoprotein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基質蛋白(matrix protein，M)、糖蛋白(glycoprotein，G)以及RNA依賴的RNA聚合酶大蛋白(RNA-dependent RNA polymerase large protein，L)，其中RABV糖蛋白(RABV-G)是病毒粒子表面唯一的蛋白，在RABV感染宿主后結合細胞表面的受體幫助入侵，同時也能夠刺激機體產生保護性中和抗體(virus-induced neutralizing antibody，VNA)。

狂犬病在全球范圍內每15 min發生1例，其中95% 以上病例發生在亞洲、非洲的一些發展中國家和欠發達地區[1]。人通常是通過已感染RABV的動物咬傷、抓傷或舔舐等密切接觸方式被感染。狂犬病一旦出現臨床癥狀其死亡率接近100%，暴露后預防處置(包括傷口清洗、疫苗免疫和抗體注射)是預防狂犬病的唯一有效途徑[2]。犬是當前狂犬病傳播的主要傳染源(占比95%以上)，對家養動物進行廣泛免疫(達到70%以上)是消除人間狂犬病的最有效措施。

世界衛生組織(WHO)提出了2030年消滅人間狂犬病的目標[3]，而要實現這一目標就需要開發更為廉價、高效的新型狂犬病疫苗。早在1885年法國科學家路易斯·巴斯德就首次發明了狂犬病疫苗，并成功應用到人狂犬病的防控[4]。時至今日，狂犬病疫苗的發展歷經組織滅活苗、禽培苗、細胞苗、基因工程苗等不同的發展階段。得益于基因工程技術的飛速發展，近年來狂犬病新型基因工程疫苗研究獲得長足進步，本文對該方面的研究進展進行系統綜述。

1 狂犬病新型滅活疫苗

滅活疫苗具有非常高的安全性，但狂犬病傳統滅活疫苗免疫后效力較低，持續時間較短，需多次免疫，免疫程序相對繁瑣。狂犬病新型滅活疫苗則采用反向遺傳操作技術對毒株改造后再制備滅活疫苗，從而提高疫苗免疫原性。RABV-G是RABV誘導機體產生中和性抗體的唯一抗原，因此，提高RABV-G的表達量是增強滅活疫苗免疫原性的策略之一。如將含有2個RABV-G基因(將另外1個拷貝的G基因插入在G/L間)的重組病毒株rHEP-dG制備的滅活疫苗免疫小鼠和比格犬后，較親本毒制成的滅活疫苗能誘導產生更高水平的VNA[5]。此外密碼子優化也是提高RABV-G表達量的策略之一，如在G/L間額外插入1個RABV-G，并對2個RABV-G均進行鼠源密碼子優化的重組RABV滅活后免疫小鼠能產生更高水平的VNA[6]，是優良的狂犬病滅活疫苗候選株。而另一項研究表明，表達2個RABV-G的重組RABV滅活后進行的小鼠免疫試驗顯示將額外的1個G基因插入到G/L間較P/M間能更好地誘導機體產生VNA[7]，這表明誘導機體產生VNA不僅和RABV-G的表達量有關(RABV復制過程中蛋白表達量按N-P-M-G-L的順序依次遞減)，還存在其他未知影響因素。除了增加RABV-G表達量外，與RABV-G偶聯表達外源免疫激活因子也同樣可以增加疫苗免疫原性。例如，與RABV-G融合表達B細胞激活因子(B cell activating factor，BAFF)并展示在病毒粒子表面的重組RABV滅活疫苗能刺激小鼠短時間內產生高滴度VNA[8]，可開發為暴露后免疫疫苗。

此外，以RABV為載體來表達其他病原保護性抗原而開發的重組二聯滅活疫苗也是新型滅活疫苗的發展方向之一。如基于RABV-G的蛋白三維結構，設計構建的RABV和莫科拉病毒(mokola virus，MOKV)嵌合G蛋白重組滅活疫苗候選株免疫后能為機體提供對RABV和狂犬病病毒屬的多種病毒在內的免疫保護[9]，極大地拓寬了狂犬病疫苗的應用范圍。而表達犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)H(CDV-H)或F蛋白(CDV-F)的重組狂犬病滅活疫苗在提供RABV免疫保護的同時也能提供CDV免疫保護[10]；采用汽化保存的RABV-埃博拉病毒(ebola virus，EBOV)重組滅活疫苗比冷藏保存的滅活疫苗具有更好的熱穩定性，能同時保護機體免受RABV和EBOV的攻擊[11]；表達SARS-CoV-2 S1與RABV-G嵌合體的RABV-COVID-19重組滅活疫苗CORAVAXTM免疫小鼠56 d后，仍能誘導機體同時產生針對以上2種病毒的高水平VNA[12]。

2 狂犬病新型弱毒疫苗

RABV反向遺傳操作系統的建立和發展為RABV弱毒活疫苗的開發提供了便利的工具[13]。利用反向遺傳操作技術可將與RABV致病性相關的關鍵氨基酸位點突變，進而構建獲得高度弱化的狂犬病活疫苗候選株。如將RABV-G和M基因位置交換且G蛋白333位氨基酸突變(R333E)而高度致弱的RABV活疫苗(ERAg3m株)單次肌肉注射3周后能在致死劑量的RABV街毒(MD5951株)攻擊下為倉鼠和小鼠提供100%保護，比滅活疫苗具有更高的免疫保護率，可作為暴露后免疫候選疫苗株[14]。另一項研究表明，RABV ERA株N基因和G基因同時突變(N273/394-G333)而高度致弱毒株具有更高的安全性[15]；基因改造(G基因N194S和R333E同時突變)的RABV ERAGS 株用作疫苗免疫后能誘導小鼠、貉、豬、犬和牛等產生保護性免疫力[16-18]。此外，串聯表達3個拷貝G蛋白的重組RABV(SPBAANGAS-GAS-GAS)弱毒在小鼠體內幾乎無致病性且免疫原性強，可作為暴露前和暴露后免疫預防疫苗候選株[19]。

為了進一步提高疫苗安全性，通過反向遺傳操作系統開發的M基因缺失的復制缺陷型狂犬病疫苗(RABV-ΔM)由于僅能在宿主體內復制1輪，因此具有極高的安全性，同時也能為犬提供較長時間免疫保護[20]。類似開發的RABV-P基因缺失并表達MERS-S1的復制缺陷型狂犬病疫苗(RABVΔP-MERS/S1)同樣也具有較高的安全性，并能同時提供對中東呼吸道綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)和RABV的免疫保護[21]。

值得關注的是，能夠表達免疫增強因子或調節因子的重組狂犬病疫苗近年來也相繼涌現，其策略是利用反向遺傳操作系統將促進免疫反應的細胞因子或趨化因子插入病毒基因組，使其隨病毒復制而表達，進而增強疫苗的體液免疫效果(圖1)。目前主要有2種增強宿主體液免疫反應的策略：一種是激活宿主的抗原遞呈細胞，主要是樹突狀細胞(dendritic cell，DC)，如表達優化的高遷移率群組框1(high-mobility group box 1，HMGB1)的重組RABV能通過激活DC而增加RABV免疫原性，從而激活更多的體液免疫[22]；融合表達靶向樹突狀細胞小肽(DCBp)的重組RABV可促進DC的成熟，進而促進下游體液免疫的產生[23]；而表達Fms樣絡氨酸激酶3配體(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt3L)的重組RABV小鼠免疫試驗顯示能招募并激活DC，進而促進機體產生高水平VNA[24]。另外一種策略是激活產生抗體的主要部位-生發中心(germinal center，GC)，促進生發中心B細胞的生成。如表達C-X-C基序趨化因子13(C-X-C motif chemokine，CXCL13)的重組RABV能促進引流淋巴結生發中心的形成，小鼠免疫試驗顯示其誘導產生更多的GC B細胞并激活更多的漿細胞從而產生更多的VNA[25]；表達細胞內黏附分子1(intracellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的重組RABV也能激活更多的B細胞，在低劑量免疫下即能迅速誘導VNA產生[26]，有作為RABV暴露后免疫預防疫苗的潛力；表達BAFF的重組狂犬病疫苗能快速激活濾泡外B細胞，并在短期內產生高水平VNA，可作為暴露后預防疫苗[27]；表達共刺激因子OX40配體(costimulatory factor OX40-ligand，OX40L)的重組RABV免疫小鼠后可產生大量的濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cells，Tfh)、GC B細胞和漿細胞，從而持續產生高水平VNA[28]。此外，一些表達白介素如IL-6[29]、IL-7[30]、IL-15[31]、IL-18[32]、IL-21[33]的重組RABV都能不同程度地增強疫苗的體液免疫，顯著提高VNA滴度，其中IL-7還可以促進記憶B細胞的產生，增強長效免疫應答。

圖1 表達免疫增強因子的狂犬病新型弱毒疫苗示意圖Fig.1 Schematic diagram of new attenuated rabies vaccine expressing immune enhancement factor

通過表達細胞因子或趨化因子來提高疫苗的免疫原性可以有效提高狂犬病疫苗的免疫效力，但是在動物或人體內過表達這些細胞因子是否會存在一定的副作用或有其他安全性隱患還需進一步評估。

3 狂犬病新型活載體疫苗

利用其他病毒載體表達RABV-G也是狂犬病新型疫苗研究的熱點之一。痘病毒(vaccinia virus)在1982年就被開發成表達外源基因的載體，隨后開發了表達RABV-G的重組痘病毒載體疫苗(V-RG)并作為野生動物口服活載體疫苗在北美洲使用多年[34-36]，該重組病毒具有較好的熱穩定性，但免疫效果在部分野生動物中不是很理想。而金絲雀痘病毒(canarypox)載體重組狂犬病疫苗(PUREVAX?Feline Rabies and PUREVAX? Rabies，Merial)可為貓提供長達3 a的免疫保護[37]，具有很高的應用價值。腺病毒載體也是狂犬病疫苗開發的優良載體，ONRAB?就是基于人腺病毒5型(human adenovirus 5，AdHu5)載體開發的野生動物用口服狂犬病疫苗[38-42]，在消除野生動物狂犬病方面具有較好的應用前景。也有研究表明將分別表達RABV-G和RABV-N的重組腺病毒組合免疫小鼠能提供更好免疫保護[43]；而同時表達RABV-G和CDV-H的重組腺病毒二聯苗(rAd5-G-H)能為小鼠和狐貍同時提供針對RABV和CDV的免疫保護[44]；同時表達重癥熱性血小板減少癥候群病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)Gn和RABV-G的重組腺病毒Ad5-G-Gn免疫小鼠也能誘導產生針對以上2種病毒的VNA，可作為犬、貓候選疫苗[45]。值得關注的是近年來非人靈長類腺病毒載體疫苗也發展迅速，如基于復制缺陷型黑猩猩腺病毒載體開發的狂犬病疫苗(ChAd155-RG)被認為是下一代人用狂犬病疫苗候選株[46]。黑猩猩腺病毒載體狂犬病疫苗(ChAd68-Gp)能為比格犬提供致死劑量的RABV(CVS-11)攻擊保護[47]；此外，猴腺病毒載體狂犬病疫苗(ChAdOx2 RabG)也可被開發為廉價的犬用狂犬病疫苗[48]。

除常用的痘病毒和腺病毒載體外還有許多其他病毒載體也被用來研究作為狂犬病疫苗載體的可行性。如表達RABV-G的副痘病毒(Orf virus，ORFV)能為小鼠、貓、犬和家畜提供免疫保護[49-50]；而貓皰疹病毒1(feline herpesvirus 1，FHV-1)載體開發的貓用狂犬病疫苗對消除貓狂犬病和貓-人傳播途徑至關重要[51]。此外,表達RABV-G的重組桿狀病毒(baculoviridae)疫苗可為小鼠提供致死劑量RABV(CVS-24)的攻擊保護[52]；重組腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)表達的RABV-G能在小鼠體內誘導長達1 a以上的體液免疫反應，保護小鼠免受RABV(CVS-24)的致死性攻擊[53]。而基于西尼羅病毒(west nile virus，WNV)載體開發的表達RABV-G的復制子(RepliVax?)疫苗也能為小鼠、犬和豬提供免疫保護[54]；重組SFV病毒(semliki forest virus，SFV)載體疫苗可以在哺乳動物細胞大量表達RABV-G[55]，從而可開發為狂犬病疫苗。另外，還有采用犬腺病毒-2(canine adenovirus type 2，CAV-2)[56]、新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)[57-58]、副流感病毒5型(parainfluenza virus 5，PIV5)[59]、犬瘟熱病毒[60]等病毒載體開發的獸用狂犬病疫苗。這些病毒載體狂犬病疫苗有些已用于野生動物，有些只開展了臨床前研究，但對開發動物用甚至人用狂犬病疫苗都具有重要的價值，具備開發成廉價、高效的下一代狂犬病疫苗的潛力。

4 狂犬病新型核酸疫苗

狂犬病核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗。狂犬病DNA疫苗主要通過將編碼RABV-G的編碼框構建到真核表達載體上，免疫后利用宿主細胞翻譯表達RABV-G從而刺激機體產生VNA。傳統DNA疫苗免疫效果不夠理想，持續時間短，狂犬病新型DNA疫苗多通過添加佐劑提高免疫效果。如添加了C3d-P28佐劑的編碼G5線性多肽的狂犬病DNA疫苗(pVaxF1)克服了DNA疫苗免疫劑量大、效果差的弱點，能夠持續刺激機體產生RABV特異性VNA[61]；添加鋁佐劑的pgp.LAMP-1狂犬病DNA疫苗也能提供針對RABV的免疫保護[62]；通過共表達TLR通路中重要接頭分子MyD88的狂犬病DNA疫苗也能有效提高其免疫效果[63]。此外，由殼聚糖[64]、泊洛沙姆[65]、聚醚亞胺(PETIM)高分子樹脂[66]等納米顆粒包裹的DNA疫苗都能有效提高狂犬病DNA疫苗的傳遞效率，從而提高疫苗免疫效果[67]。

狂犬病RNA疫苗則是將RABV-G的編碼框構建成能獨立翻譯RABV-G的mRNA作為免疫原而開發的新型疫苗(圖2)。如編碼RABV-G的非復制且耐高溫狂犬病mRNA疫苗能對小鼠、新生和成年豬產生免疫保護[68-69]；人用預防性狂犬病mRNA疫苗(CV7201)是由編碼RABV-G的mRNA和魚精蛋白組合凍干的熱穩定型mRNA疫苗，是第一個在健康人群中開展概念驗證研究的mRNA疫苗，其臨床試驗也顯示出較好的安全性和免疫原性[70-71]。此外，基于甲病毒(alphavirus)基因組構建并由陽離子納米乳劑(cationic nanoemulsion，CNE)傳遞的狂犬病自我復制mRNA(self-amplifying mRNA)疫苗在小鼠中具有較好的免疫效果和安全性[72]；而將編碼RABV-G的cDNA進行體外轉錄后轉染BHK-21細胞，包裝成能表達RABV-G的重組SFV-RABV-G的mRNA疫苗也能在小鼠體內激發有效的免疫反應[73]。

圖2 狂犬病新型mRNA疫苗示意圖Fig.2 Schematic diagram of new mRNA vaccine for rabies

5 狂犬病新型亞單位疫苗和病毒樣顆粒疫苗

直接將人工表達的RABV-G作為免疫原而開發的疫苗稱為狂犬病亞單位疫苗。傳統RABV-G表達采用原核表達系統或昆蟲細胞表達系統[74]，而采用黑腹果蠅S2(schneider 2)細胞表達的RABV-G也具有較好的免疫效果[73,75]。而采用哺乳動物細胞HEK-293T表達的嵌合有GCN4-pⅡ三聚化功能域的RABV-G胞外域嵌合體蛋白可以三聚體形式存在，因而更接近天然的RABV-G從而具有更好的免疫原性，能為小鼠提供更好的免疫保護[76]。此外，添加犬熱休克蛋白Gp96佐劑的狂犬病多肽疫苗免疫試驗和攻毒保護試驗結果顯示能為小鼠和比格犬提供免疫保護[77]，表明合成肽也具有發展狂犬病疫苗的應用前景。

RABV病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)可由RABV-G形成(需RABV-M輔助形成)，因不具有感染和復制能力，且能很好地展示抗原表位而具有良好的疫苗發展潛力。傳統的VLP多用昆蟲細胞表達系統來實現，而采用哺乳動物細胞HEK-293表達的RABV-VLP同樣具有較好的免疫原性[78-79]。此外，將GM-CSF嵌合在RABV-VLP表面則可以激活更多的樹突狀細胞，從而增強RABV體液免疫反應[80]；含有膜錨定鞭毛蛋白(EVLP-F)或大腸桿菌熱不穩定腸毒素B亞單位(EVLP-L)分子佐劑的2個嵌合病毒樣顆粒(cRVLPs)能在小鼠和犬模型中誘導更高水平的RABV特異性免疫反應[81]。值得關注的是，表達RABV-G的委內瑞拉馬腦炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus，VEEV)載體復制子疫苗(VEEV-RABV-G)，能夠形成僅包含RABV-G單一蛋白的類病毒粒子，并且可以在BHK-21細胞中連續傳代，VEEV-RABV-G在乳鼠和小鼠腦內直接注射均展現出極高的安全性，并且能夠提供與狂犬病弱毒疫苗相當的免疫保護，可以作為下一代安全、高效的疫苗候選株[82](圖3)。

圖3 新型狂犬病病毒樣顆粒疫苗VEEV-RABV-G示意圖Fig.3 Schematic diagram of the new rabiesvirus-like particle vaccine VEEV-RABV-G

6 狂犬病口服疫苗

由于使用的便利性，口服疫苗對消除流浪犬、貓和野生動物中的狂犬病從而降低人間狂犬病具有重大的意義[83-86]。因此上述狂犬病疫苗若能開發成口服疫苗則對狂犬病防控和消除意義重大[87]，令人欣喜的是已有相關探索和應用研究，如SAG2是由RABV 疫苗株SAD-Bern經突變篩選的高度致弱的狂犬病口服疫苗，在犬及其他野生動物試驗中顯示較好的安全性和有效性[88-89]；而由SAD-L16派生出的口服疫苗SPBN-GASGAS 可為狐貍[90-91]、浣熊[90]和犬[92]提供有效的狂犬病保護。此外，基于人腺病毒載體的狂犬病口服疫苗ONRAB?已在北美洲的野生動物中應用多年[42]；痘病毒載體狂犬病口服疫苗V-RG也在北美洲野生動物狂犬病控制中發揮了重要的作用[36]。RABV ERA株G蛋白R333E突變致弱的狂犬病口服疫苗在犬試驗中是安全的，且能提供長時間的免疫保護[93]。而表達犬粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的重組RABV口服疫苗，能募集和激活更多的樹突狀細胞，誘導犬產生更高水平的VNA[94]。而以犬腺病毒2型為載體的狂犬病疫苗(CAV-2-E3Δ-RGP)經口服也可為犬提供長效免疫保護，但也有研究表明犬體內已有的針對犬腺病毒的抗體可能會影響免疫效果[95]。

除了病毒載體，利用可食用轉基因植物表達保護性抗原從而免疫人群和動物也是提高群體免疫的有效途徑[96]。而據此開發的表達RABV-G的轉基因玉米口服綿羊后能誘導機體產生針對RABV的保護性免疫應答[97]。此外，在番茄毛狀根中表達RABV-G也可被開發為動物用口服疫苗[98]。

7 展 望

要實現WHO倡議的在2030年消除人間狂犬病的目標依然任重道遠。2007年我國因狂犬病死亡的人數約3 300人，位居全球第二，僅次于印度。近年來，隨著狂犬病疫苗在家養動物中的廣泛應用，我國每年死于狂犬病的人數已逐年下降至2020年的300例以下。疫苗免疫是消除人間狂犬病最有效的措施，針對3個主要的免疫群體——人、寵物和野生動物，需要根據不同需求開發更為有效的新型疫苗。由于人用疫苗將安全性置于首位，目前人用狂犬病疫苗均為滅活疫苗，需多次免疫(4～5針)后才能產生有效的VNA，免疫程序繁瑣，且費用較高，因此研發安全性高、只需1針免疫、長效的狂犬病疫苗是人用狂犬病疫苗的發展方向，而mRNA疫苗和類病毒粒子疫苗是未來人用狂犬疫苗的發展重點。當前狂犬病的主要傳染源為犬，尤其是農村犬和流浪犬，而只有在犬、貓中實現70%以上的免疫覆蓋率才能有效降低人間狂犬病的發病率，因此，迫切需要開發廉價、高效的獸用狂犬病疫苗，經過密碼子優化的滅活疫苗和類病毒粒子疫苗具有較好的應用前景。鑒于RABV儲存宿主是野生動物，要消除狂犬病終究要實現野生動物的廣泛免疫。因此，廣泛應用基于RABV弱毒或者其他活病毒載體開發的安全、有效的狂犬病口服疫苗來提高野生動物的免疫率則是未來最終消除狂犬病的關鍵舉措。