氮肥/花生餅肥配施對番茄根際土壤及根系內生細菌群落結構的影響

龐師嬋王帥帥張文靜黃子粵覃仁柳肖健唐小付楊尚東

1.廣西大學農學院/植物科學國家級實驗教學示范中心，南寧 530004； 2.陜西省榆林市蔬菜產業發展中心， 榆林 719000

番茄富含番茄紅素,擁有強抗氧化功能，具有提高機體免疫、延緩衰老的作用；同時，番茄中富含蘋果酸、檸檬酸和各種糖類，對調整胃腸功能、降低膽固醇以及減緩高血脂癥狀頗有益處[1-2]。番茄是廣西“南菜北運”和“西菜東調”的重要蔬菜品種之一。但隨著其生產規模逐年擴大[3]，以及長期不科學地施肥，導致廣西番茄產區土壤氮、磷、鉀養分比例失衡,土壤酸化加劇，青枯病等土傳病害頻發，連作障礙發生嚴重[4-5]。生產者為了保持和提高番茄產量，盲目地施用化肥與農藥；其中，氮肥的過量施用問題尤其突出。據統計，我國部分蔬菜產地全年氮肥施用量高達1 732 kg/hm2，蔬菜施用的氮肥其一半的氮素直接揮發，并有5%～10%流失[6]。過量施用氮肥不僅導致地表水富營養化，還會引起地下水硝酸鹽污染[7]。目前,如何提高我國蔬菜生產中的氮肥利用率，減量施用氮肥是蔬菜生產中的一個重要研究方向。研究表明，科學合理地施肥不僅可以有效地提高土壤肥力，而且有助于維護土壤健康[8]；其中，有機肥和化肥配施不僅可以提高作物產量和品質，而且有助于增加土壤肥力、維護土壤健康[9-10]。同時，土壤微生物對土壤理化性狀的變化非常敏感，至今已被廣大科技工作者用作反映土壤肥力狀況及質量評價的生物學指標[11]。根際土壤細菌作為根際微生態環境的重要組成部分，對土壤環境變化十分敏感，同時在植物根際土壤有機質的分解、氮的固定以及土壤養分轉化過程中發揮著重要的作用[12]。另一方面，植物內生細菌分布在植物各個部位，不僅具有種屬多樣性特征，而且具有固氮[13-14]、解磷[15]、產生植物生長調節物質[16]、增強宿主抗性[17]和生物修復[18]等功能，對調節宿主體內的微生態平衡、增強抗逆性和促進宿主植物的健康生長發揮著重要作用[19-20]。為此，本研究設置不施肥(A)、100%氮肥(B)、75%氮肥/25%花生餅肥(C)、50%氮肥/50%花生餅肥(D)、25%氮肥/75%花生餅肥(E)及100%花生餅肥(F)共6組處理，基于高通量測序技術，分析番茄植株根際土壤及根系內生細菌多樣性，旨在為番茄生產中科學施用氮肥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

“櫻粉1號”番茄種子來自廣西大學農學院；花生餅肥購于南寧市農貿市場，含氮量為5.84%；氮肥(尿素)購置于光耀農資園藝，含氮量為46.4%。本試驗于2018年9月至2019年12月在廣西大學農學院蔬菜生產基地(東經108°18′，北緯22°51.2′)進行。試驗根據番茄全生育期所需氮量約8 g[21-22]進行施肥，按7∶3的比例分基肥、追肥分2次施肥。基肥配施于番茄移栽前，追肥從第一花序肥大期開始進行，追肥時根據表1追肥量，撒施于植株根系周圍后等量覆土；同時，不施肥處理亦做相同的等量覆土處理。試驗設計見表1。

表1 試驗設計及施肥量Table 1 Experimental design and fertilizer application g

定植土壤pH 5.50，有機質含量6.20 g/kg，全氮0.86 g/kg，全磷0.54 g/kg，全鉀14.5 g/kg，堿解氮57.3 mg/kg，速效磷3.56 mg/kg，速效鉀80.6 mg/kg。試驗期間除草灌溉、病蟲害防治等管理措施按常規方法進行相同管理。

1.2 樣品采集與分析方法

育苗至長出第3片真葉時移栽。番茄定植至果實成熟,進入采收期后隨機取樣。每個處理均隨機取9株番茄根際土壤，混合3株土樣為1個重復，即每個處理3個重復。采用抖根法[23]采集各個施肥處理番茄根際土壤，裝入無菌袋的后混勻。樣品經孔徑2 mm的篩網過篩后，裝入無菌袋，用于分析土壤細菌群落結構。番茄根系經滅菌蒸餾水洗滌、瀝干后，裝入無菌袋，用于內生細菌分析。

根際土壤細菌及根系內生細菌群落結構分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司使用 Miseq[24]平臺進行高通量測序。原始數據上傳至NCBI數據庫中比對。

1.3 數據處理

采用Excel 2013和SPSS 20.0統計軟件對試驗數據進行統計分析，多重比較采用鄧肯氏新復極差檢驗法(Duncan’s multiple ranger test，DMRT)。利用生物科技公司提供的云數據分析平臺I-sanger進行Alpha多樣性及物種組成Venn圖分析。采用Shannon指數和Simpson指數表征番茄根際土壤細菌和根系內生細菌多樣性，Chao1指數指示細菌豐富度。

2 結果與分析

2.1 樣本序列數據分析

由表2可知，與不施肥處理(A)相比，施肥處理均不同程度地改變了番茄植株根際土壤細菌和根系內生細菌不同分類水平數量；其中，氮肥與餅肥配施對根際土壤細菌和根系內生細菌不同分類水平的影響總體上呈提升效果；但單一的氮肥或餅肥處理，雖然提高了番茄植株根際土壤細菌不同分類水平數量，但整體上均導致根系內生細菌不同分類水平數量下降。

表2 不同施肥處理番茄植株根際土壤和根系內生細菌的不同分類階元歸類數量Table 2 Number of endophytic bacteria in rhizosphere soil and root of tomato under different fertilization treatments

2.2 細菌多樣性分析

與不施肥處理(A)相比，不同施肥處理對番茄植株根際土壤細菌多樣性Shannon 和Simpson指數無顯著影響，但對豐富度Chao1指數的影響效果各異。單一的氮肥(B)和低比例的餅肥處理(C)具有降低番茄植株根際土壤細菌豐富度的趨勢(表3)。

另一方面，與不施肥處理(A)相比，單一的氮肥和餅肥處理(B和F)不僅導致番茄植株根系內生細菌多樣性顯著降低，而且還導致根系內生細菌豐富度顯著降低；此外，氮肥與餅肥配施對番茄根系內生細菌多樣性和豐富度的影響效果依氮肥與餅肥的配比而異，提升效果最優的施肥處理為75%的氮肥和25%的餅肥配比，其次為氮肥和餅肥配比各占50%的處理(D)(表3)。

表3 不同施肥處理番茄植株根際土壤和根系內生細菌Alpha多樣性指數Table 3 Alpha diversity index of endophytic bacteria in rhizosphere soil and root of tomato under different fertilization treatments

綜上，施肥處理不僅影響番茄植株根際土壤細菌的多樣性與豐富度，也對植株根系內生細菌的多樣性與豐富度有重要影響；單一的化肥或餅肥施用導致番茄植株根際土壤或內生細菌多樣性與豐富度降低，不利于番茄植株根際微環境土壤健康與植株抗逆(病)能力的提升。

2.3 細菌群落組成分析

1)細菌門分類水平。由圖1可知，不同施肥處理番茄植株根際土壤中，細菌門分類水平組成的占比大于1%的優勢細菌主要由10個菌門組成，分別是變形菌門 (Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門 (Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、己科河菌門(Rokubacteria)、Patescibacteria和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)，占比小于1.0%的非優勢菌門的分類歸屬于其他(Other)門類。此外，雖然不同施肥處理番茄根際土壤中，優勢細菌門分類組成相同，但不同施肥處理條件下，相同菌門分類占比表現各異，如：不施肥處理中，變形菌門 (Proteobacteria)細菌的占比為33.5%，單一的氮肥、餅肥和不同配比氮肥/餅肥處理中的占比分別為19.47%、22.29%、21.29%、26.42%和22.46%，不同施肥處理改變了番茄植株根際土壤中優勢細菌門分類水平組成的占比(圖1)。

圖1 不同施肥處理下根際土壤細菌門分類水平組成分布Fig.1 The distribution of soil bacterial community structure in rhizosphere at phylum level

同樣地，不同施肥處理條件下，番茄植株根系內生細菌門分類水平主要由變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)組成(圖2)。

但不同施肥處理顯著影響了番茄植株根系優勢內生細菌門分類水平組成。其中，單一的氮肥處理，占比大于1%的根系優勢內生細菌門分類組成由不施肥處理的4個優勢菌門銳減至2個菌門，僅由變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)組成；單一花生餅肥處理則僅剩變形菌門(Proteobacteria)1種優勢菌門；氮肥/餅肥不同配比處理中，隨著配比中氮肥比例降低、花生餅肥比例提高，番茄植株根系中，變形菌門(Proteobacteria)內生細菌的占比逐漸提高，放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)細菌占比逐步降低(圖2)。

圖2 不同施肥處理下根系內生細菌門分類水平結構分布Fig.2 The distribution of endophytic bacterial community structure in root at phylum level

2)細菌屬分類水平。由圖3可知，不同施肥處理條件下，番茄植株根際土壤中的優勢細菌屬由norank_c__subgroup_6、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)等15個優勢菌屬組成(表4)。其中，norank_c__subgroup_6、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、norank_o__Gaiellales、norank_f__Roseiflexaceae、黃色桿菌屬(norank_f__Xanthobacteraceae)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Gaiella等7個細菌屬是不同施肥處理條件下番茄植株根際土壤中的共有優勢菌屬。此外，norank_c__KD4-96是不施肥處理番茄植株根際土壤中的特有優勢菌屬；norank_f__JG30-KF-CM45是單一氮肥處理及氮肥高配比(75%)處理中的特有優勢菌屬；微桿菌屬(Microbacterium)細菌則是氮肥高配比(75%)和單一餅肥處理中的特有優勢菌屬；RB41是單一餅肥處理的特有優勢菌屬；而芽孢八疊球菌屬 (Sporosarcina)則是低氮素配比(25%)餅肥處理中的特有優勢菌屬。結果表明：不同施肥處理不僅改變了番茄根際土壤中優勢細菌屬組成的占比，而且還改變了番茄根際土壤中的優勢細菌屬組成。

圖3 根際土壤細菌屬分類水平結構分布圖Fig.3 The distribution of soil bacterial community structure in rhizosphere at genus level

表4 根際土壤優勢細菌屬分類水平的組成占比Table 4 The proportion of dominant soil bacteria in rhizosphere at genus level

同樣地,不同施肥處理不僅改變了番茄植株根系內生細菌優勢菌屬的占比，而且亦改變了優勢菌屬組成(圖4)。

圖4 根系內生細菌屬分類水平結構分布Fig.4 The distribution of endophytic bacterial community structure in root at genus level

與不施肥處理(A)相比，單一的氮肥處理導致假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘脂菌屬(Sphingobium)以及泛菌屬(Pantoea)等7種優勢菌屬缺失；單一的餅肥處理(F)同樣導致了克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)等8種優勢菌屬缺失；氮肥/餅肥配施處理雖然擁有與不施肥處理相同數量的優勢內生菌屬，但種類發生了明顯變化。與不施肥處理相比，高氮肥(75%)/餅肥配比的處理(C)中，缺失了青枯菌屬(Ralstonia)、泛菌屬(Pantoea)、微桿菌屬(Microbacterium)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、塔特姆菌屬(Tatumella)等優勢細菌，但富集了艾德昂菌屬(Ideonella)、游動放線菌屬(Actinoplanes)、norank_f__Moraxellaceae、unclassified_f__Rhizobiaceae、芽孢桿菌屬 (Bacillus)等優勢細菌屬；50%氮肥和50%餅肥配比處理(D)中，則缺失了不施肥處理的泛菌屬、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium和塔特姆菌屬 (Tatumella)細菌，但同樣富集了艾德昂菌屬(Ideonella)、游動放線菌屬(Actinoplanes)和Lechevalieria屬細菌；而25%氮肥和75%餅肥配比處理(E)中，缺失了不施肥處理中的微桿菌屬(Microbacterium)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium和塔特姆菌屬(Tatumella)細菌，同時富集了艾德昂菌屬(Ideonella)、norank_f__Moraxellaceae和疣孢菌屬(Verrucosispora)細菌。綜上，不同施肥處理同樣改變了番茄植株根系內生細菌的群落結構，單一的氮肥或餅肥處理不僅不利于提高番茄植株根系內生細菌群落的多樣性和豐富度，而且還導致部分優勢內生細菌屬缺失，從而降低了植株的抗性(表5)。

表5 根系優勢內生細菌屬分類水平的組成占比Table 5 The proportion of dominant endophytic bacteria in root at genus level

3)屬分類水平Venn圖。單一的氮肥或餅肥處理以及不同氮肥/餅肥配比處理番茄植株根際土壤中，細菌屬分類水平數量均高于相應的不施肥處理，但不同施肥處理無助于提高番茄植株根際土壤中的特有細菌屬分類水平數量；與不施肥處理相比，僅單一施用氮肥處理特有細菌屬數量與不施肥處理持平，均為9個，單一的餅肥處理以及不同氮肥/餅肥配比施肥均導致番茄植株根際土壤中特有的細菌屬分類水平數量下降(圖5-1)。

另一方面，不同施肥處理亦改變了番茄植株根系內生細菌屬分類水平數量。與不施肥處理相比，單一的氮肥和餅肥處理均導致了番茄植株根系內生細菌屬分類水平數量的下降，分別由不施肥處理的241下降至184和101，且缺乏特有的細菌屬(圖5-2)。不同氮肥/餅肥配比施肥則有助于提高番茄植株根系內生細菌屬分類水平數量，尤其以50%氮肥和50%餅肥配比的處理提升效果最佳；但隨著餅肥比例的增加，至餅肥比例達75%時，與不施肥處理相比屬分類水平數量基本一致。但氮肥/餅肥配施均不同程度地提高了番茄植株根系內生細菌特有的細菌屬分類水平數量。研究結果表明：氮肥/餅肥配施不僅有助于提高番茄植株根系內生細菌屬分類水平數量，尤其有利于增加植株根系特有的內生細菌屬數量，從而增強了植株抵御外界環境或病害脅迫的能力。

1.根際土壤細菌 Soil bacteria in rhizosphere; 2.根系內生細菌 Endophytic bacteria in root.圖5 根際土壤細菌、根系內生細菌屬分類水平Venn圖Fig.5 Venn diagram of the soil bacteria in rhizosphere and endophytic bacteria in root at genus level

3 討 論

土壤細菌作為土壤微生物群落中最大的類群，其占比高達70%～90%，是承擔維護土壤健康與土壤肥力以及促進植物吸收土壤養分的重要角色之一[25]。植物內生細菌則是植物微生態系統的重要組成部分，其在植物不同器官分布數量存在差異。其中，根系內生細菌群落結構易受環境因素影響[26]。

本研究中施肥處理不僅改變了番茄植株根際土壤細菌和根系內生細菌不同分類水平數量，而且氮肥/餅肥配施對根際土壤細菌和根系內生細菌不同分類水平的影響總體上呈提升效果；但單一的氮肥或餅肥處理，雖然提高了番茄植株根際土壤細菌不同分類水平數量，但整體上均導致根系內生細菌不同分類水平數量下降。這一結果與趙力光等[27]和靳曉拓等[28]研究化肥減量配施有機肥對土壤細菌多樣性和豐富度影響的結果類似。

門分類水平上，變形菌門 (Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門 (Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、己科河菌門(Rokubacteria)、Patescibacteria和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)是不同施肥處理番茄植株根際土壤中的優勢細菌門分類。但相同優勢細菌門分類占比在不同施肥處理中表現各異。這一結果表明，基于門分類水平，施肥處理對番茄植株根際土壤中的細菌群落結構并無顯著影響，僅僅改變了根際土壤細菌群落組成的占比；與之相比，施肥處理則顯著改變了番茄植株根系內生細菌群落組成，尤其單一的氮肥或餅肥處理，根系優勢內生細菌群落組成由不施肥處理的4個優勢細菌門類銳減至2個；但有機/無機(氮肥/餅肥)配施處理則沒有發生單一化肥或有機肥處理相同的現象，僅發生優勢細菌門類組成占比的變化。這一現象表明：單一的化肥或有機肥施用處理，容易引起番茄植株內生細菌群落結構失衡，存在導致植株抗性減弱的可能性。

屬分類水平上，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Gaiella、norank_c__subgroup_6、norank_o__Gaiel上lales、norank_f__Roseiflexaceae、黃色桿菌屬(norank_f__Xanthobacteraceae)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等7個細菌屬是不同施肥處理條件下番茄植株根際土壤中的共有優勢菌屬，但不同施肥處理番茄植株根際土壤中，與不施肥處理相比，僅高比例的餅肥和單一的餅肥處理植株根際土壤中存在特有的優勢細菌屬：芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)和RB41；這一結果表明，施用有機肥更有助于富集土著細菌以外的細菌屬，與化肥相比更有助于改變土壤細菌群落結構。另一方面，不同施肥處理亦改變了番茄植株根系內生細菌的群落結構；單一的氮肥或餅肥處理不僅無助于提高番茄植株根系內生細菌群落的多樣性和豐富度，而且導致部分優勢內生細菌屬缺失、青枯菌屬細菌富集成為番茄植株內生細菌的優勢菌屬。已有研究證實青枯菌屬(Ralstonia)中的茄勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)是引起番茄青枯病的病原菌[29]，表明施用單一的氮肥或餅肥均不利于番茄植株根系內生細菌群落結構平衡，容易引起植株抗性降低甚至出現病害危害癥狀。與之相比，氮肥/餅肥配施則不同程度地富集了假單胞菌屬 (Pseudomonas)和芽孢桿菌屬 (Bacillus)等有益細菌成為番茄植株根系的優勢內生細菌屬。

綜上，施肥處理對番茄植株根際土壤細菌的多樣性與豐富度有顯著影響；與單一地施用氮肥或餅肥處理相比，氮肥/餅肥配施更有利于改良番茄植株根際土壤微環境，更有助于提高番茄植株的抗性；施用單一的氮肥或餅肥處理，不僅導致番茄植株根際土壤或內生細菌多樣性與豐富度降低，而且還導致擬桿菌門(Bacteroidetes)厚壁菌門(Firmicutes)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)等根際土壤和根系內生細菌中，部分優勢細菌門、屬缺失，同時富集了青枯菌屬等病原細菌。單一的氮肥和餅肥施用處理均不利于改良番茄植株根際土壤微環境和提高番茄植株抗性，25%氮肥和75%餅肥配比是改良番茄植株根際土壤微環境及提高植株抗性的最佳配比。