不同中效稀釋粉對豬精液常溫保存效果的比較

趙展展，柳夢圓，陳雷，雷明剛

1.華中農業大學農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070； 2.湖北金旭種公豬站有限公司，襄陽 441100

人工授精(AI)是現代豬繁殖育種中不可或缺的重要一環，而精液質量直接決定AI的效果和豬場的效益[1]；但由于豬精子膜結構的特殊性，使其抗冷應激的能力較差，因此生產中99%以上AI使用常溫保存的豬精液，而稀釋粉在精液的常溫保存中扮演著非常重要的角色[2-3]。

稀釋粉決定著精液稀釋后的pH值、滲透壓、營養物質等多種關乎精液質量的關鍵指標，是影響精液質量的一個重要外在因素[1，4]。而中效稀釋粉以價格實惠、3～5 d適宜的保存時長，已然成為稀釋粉中的主力，但我國稀釋粉市場品牌紛雜，質量參差不齊，給養豬企業造成了很大的困擾[2]。因此，本研究從市場上選擇了業內知名度較高的9種中效稀釋粉進行常溫保存對比試驗，以期為養豬企業在選擇稀釋粉時提供參考，為我國制定稀釋粉相關標準以及稀釋粉進一步研發提供試驗與理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗精液和稀釋粉

試驗公豬精液來自湖北某公豬站，選擇12頭體型健壯、無生殖疾病史的杜洛克公豬，年齡在1～1.5歲，固定采精頻率為每周1次。精液的采集和初檢遵照GB/T 25172—2010和GB 23238—2009執行[5-6]。本試驗所用的9種稀釋粉由業內知名度較高的8個品牌組成，產品說明的有效保存時長均≥5 d，分別將其編號為稀釋粉A、B、C、D、E、F、G、H、I。

1.2 溶液的配制

稀釋粉的溶解按照各產品外包裝的標識進行；低滲液由3.675 g的二水檸檬酸鈉和6.750 g的果糖溶解至500 mL超純水中配合而成(現配現用)。

1.3 精液的稀釋和保存

首先依據國標《豬常溫精液生產》[5]中的要求推算稀釋密度，結合原精量和測定密度確定稀釋比。同時根據GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產與保存技術規范》[6]和NY/T 636—2002《豬人工授精技術規程》[7]的操作要求以精液與稀釋液溫差不超過1 ℃為標準進行稀釋。稀釋后待精液穩定0.5 h進行初檢。最后，將稀釋分裝后的精液用毛巾包裹好，待其溫度降至接近室溫，再放入17 ℃恒溫箱中，每隔12 h搖勻1次。

1.4 測定指標及方法

1) 酸堿度。每隔24 h取1.5 mL精液至10 mL離心管中，用pH計測定酸堿度的變化，每個樣重復測定3次。

2)活力和有效保存時長。用HT CASAⅡ系統每24 h對精液進行1次活力檢測，每個樣品重復測定3次。

活力有效保存時長指稀釋后的精液直線運動精子數占總精子的比例不低于60%的保存時長[2]。當活力連續2次檢測均低于60%，即停止該稀釋粉稀釋精液所有指標的檢測。

3)畸形率。根據前人研究結果和預試驗的分析，發現精子畸形率等指標的變化慢于精子活力的變化，故本試驗每隔48 h檢測1次精子畸形率、頂體和質膜完整率的變化。

涂片后參照南京建成《精子快速染色液說明書》進行染色，用油鏡放大1 000倍進行觀察。每個樣品制3張涂片，每張涂片至少計3個視野和200個以上的總精子，每張涂片的精子畸形率差異不超過20%，計算均值。

4)頂體完整率。由于頂體觀察的前處理和畸形的處理相同，故頂體的觀察和畸形同步進行，測定要求相同。

精子頂體完整率=所觀察頂體完整的精子數/所觀察的總精子數×100%

5)質膜完整率。質膜完整率采用低滲腫脹法(HOST)檢測，先取適量低滲液和精液于37 ℃水浴10 min，然后按精液比低滲液為1∶10的比例混勻，于37 ℃孵育15 min，期間不時上下搖晃混勻。取10 μL在顯微鏡下放大300倍，計視野下的精子總數和彎尾數，每個樣每次計200個以上總精子，根據以下公式計算彎尾率，即質膜完整率。每個樣重復測定3次，3次間差異不超過20%，求均值。

精子質膜完整率=彎尾精子數/精子總數×100%

1.5 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 不同稀釋粉對精液pH值的影響

不同稀釋粉稀釋后，精液pH值隨時間的變化情況見表1(由于試驗各公豬原精的pH差異較大，且稀釋后的變化規律相似，故此處僅列其中1頭公豬精液的pH值變化情況，此公豬原精pH為7.29)。

表1 不同中效稀釋粉稀釋精液后pH值的變化Table 1 Changes of pH value of semen diluted with different medium dilution powders

各中效稀釋粉所配稀釋液的初始pH值中僅稀釋粉D呈酸性，其余8種的初始pH值均在7.00～7.40。精液稀釋后隨著保存時間的延長，pH值整體呈先小幅上升后下降的趨勢，其中稀釋粉B和I的pH最大值與最小值相差最大，變化幅度最大，稀釋粉D和G的變化幅度最小。

2.2 不同稀釋粉對精子活力的影響

由表2不同稀釋粉稀釋的精液精子活力變化情況可知，保存的第1天各稀釋粉組活力差異不顯著(P>0.05)，稀釋粉E、H、I稀釋的精液精子活力一直較高，其中稀釋粉E的活力在保存3 d后顯著高于稀釋粉C、D、F、G(P<0.05)；而稀釋粉A、B、C間差異不顯著(P>0.05)，活力僅次于稀釋粉E、H、I。稀釋粉E和I的有效保存時長最長，達10.91 d和10.33 d，顯著高于另外6種(P<0.05)，其次為稀釋粉H、C、B、A。稀釋粉D、F的有效保存時長最短，僅5.10 d和5.55 d。

表2 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子活力的比較Table 2 Comparative analysis of the sperm motility in different medium term dilution powders %

2.3 不同稀釋粉對精子畸形率的影響

本試驗稀釋粉對精子畸形率的評定參照國標GB 23238—2009《豬常溫精液生產》中的要求執行。根據表3中精子在不同中效稀釋粉中的畸形表現可發現，在活力有效期內，畸形率整體呈先上升后下降的趨勢。稀釋粉C和I稀釋的精液在活力有效期內畸形率超過20%，其中稀釋粉C除第3天低于I外，其余時間一直顯著高于另外8種(P<0.05)；稀釋粉B的畸形率僅次于C。而稀釋粉D、E、G、H稀釋的精液畸形率較低，其中稀釋粉D、E顯著低于另外4種(P<0.05)。圖1所示為經巴氏染色后在油鏡下觀察到的正常形態精子和畸形精子。

表3 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子畸形率Table 3 Deformity rate of sperm in different medium term dilution powders %

2.4 不同稀釋粉對精子頂體完整率的影響

由表4可看出，頂體的完整率在某個時點呈迅速下降，如稀釋粉B、D、G、I在保存4～6 d時頂體完整率出現近10%的降幅。在活力有效期內，稀釋粉C、F、G的頂體完整率差異不顯著(P>0.05)。稀釋粉A除第2天外，頂體完整率一直最高，顯著高于稀釋粉C、D、F(P<0.05)。

表4 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子頂體完整率Table 4 Acrosome integrity rate of sperm in different medium term dilution powders %

圖2所示為挑選的經巴氏染色后在油鏡下觀察到的頂體完整和異常情況。

a:正常； b:梨形頭； c:尾部折斷； d:尾部卷曲； e:斷頭； f:頸部彎曲。 a:Normal； b:Pear-shaped head； c:Broken tail； d:Curled tail； e:Curled head； f:Neck bend.

a：正常； b：頂體破損； c：頂體膨脹； d：頂體全脫。 a:Normal； b:Acrosome damage； c:Acrosome expansion； d:Acrosome abscission.

2.5 不同稀釋粉對精子質膜完整率的影響

質膜完整率在活力有效期內的變化見表5。其中6種稀釋粉稀釋的精液在保存4～6 d時，精子質膜完整率出現集中快速下降，下降幅度超10%。在試驗2～12 d時，稀釋粉E、H的質膜完整率較高，其中稀釋粉H顯著高于稀釋粉D、F(P<0.05)；稀釋粉B、D、F、G的質膜完整率較低，其中稀釋粉D的質膜完整率顯著低于其余8種(P<0.05)。圖3所示為經低滲液處理后的精子彎尾情況，其中尾部發生彎曲即代表質膜正常，否則為質膜破損。

表5 不同中效稀釋粉稀釋的精液精子質膜完整率Table 5 Comparative analysis of the integrity rate of sperm in different medium term dilution powders %

a：發生彎尾，質膜正常； b：尾部筆直，質膜破損。 a：The sperm plasma membrane is normal and the tail is curved； b:The sperm plasma membrane is damaged,the tail is straight.

3 討 論

3.1 9種稀釋粉的合格率及影響因素

根據國標GB 23238—2009《豬常溫精液生產》中對精液型式檢驗合格的要求[5]，本試驗所用的9種稀釋粉稀釋的精液在72 h內，外觀均呈乳白色，無雜質、精子活力和每劑量直線運動精子數均達國家相應標準，而畸形率中除稀釋粉C稀釋的精液超20%外，其余8種均符合要求，故9種中效稀釋粉達國標要求率為88.89%。9種稀釋粉產品說明中標注的有效保存時長均≥5 d，本試驗結果表明除稀釋粉C外，其余稀釋粉在5 d內精液外觀、活力、每劑量直線運動精子數和畸形率均符合國家標準，達產品說明的合格率為88.89%。

3.2 不同稀釋粉對各指標測定結果的影響

戈新等[10]認為，精液代謝過程中產生的乳酸等物質會使精液的pH值降低，對精子的長期保存不利，所以應使用堿性稀釋液。但有研究表明精液在附睪中位于酸性環境，使其處于休眠狀態；當射精排出體外和副性腺分泌的堿性物質混合而復蘇變得活躍[22-24]。何蘭花等[25]研究認為精液儲存的最適pH值應為6.40；邢月超等[26]研究發現精液保存的最佳pH為6.40～6.50。可見，研究者們對豬精液稀釋液的適宜pH值并沒有統一的看法。雖然本試驗用的9種稀釋粉中有88.89%呈堿性，但酸堿性稀釋粉的綜合表現卻各有優劣，未能證明偏酸或偏堿綜合測定效果更好；綜合前人研究結論和本研究結果可得出，豬精液對稀釋液的pH值可能是有一定耐受性的，只要在適合的相對較大的耐受區間內即可，而非固定的某一個值或一個較小的pH范圍。

本試驗各稀釋粉稀釋精液后pH值變動幅度有一定差異，可能是由于稀釋粉D、F、G、H中的緩沖物質對穩定pH的效果較好，而稀釋粉A、B、I略差造成的。對于稀釋保存期間pH值的波動范圍，本試驗結果表明效果較好的稀釋粉C、D、G，pH值的波動范圍均較小。與邢月超等[26]發現精液在稀釋后pH值保持穩定有利于精液的長期保存的研究結論相吻合。同時，本試驗發現9種稀釋粉稀釋精液后pH值整體呈先緩慢上升后下降，這和侯麗鵬等[27]測定的3種稀釋液對精液pH值的變化結果相近。推測可能是由于精液被稀釋后，代謝產生的酸性物質被稀釋液中的緩沖物質中和，但由于緩沖物質被激活后無法立刻失活而導致pH值緩慢上升，隨著保存時間的延長，緩沖物質被完全中和，pH值隨即下降。而當使用的緩沖物緩沖效果較好或足量時，其pH值的下降和波動會相應減小。

頂體和質膜的完整率在我國現有相關標準中均未提及，但其在評判精液質量中的作用卻極為重要。頂體內包含多種受精所需的酶類，包括對頂體反應、透明帶反應等起關鍵作用的酶類，是判斷精子是否具有受精能力的重要指標[28]。質膜是保護精子的重要屏障，若受損則精子內物質發生外流，會致精子死亡，故其與精子代謝、獲能、存活時長等直接相關[29]，二者對評定精液質量均具有重要意義。

本試驗結果表明，9種稀釋粉稀釋的精液頂體和質膜完整率均存在較大差異，對應活力和畸形率的變化可發現，頂體和質膜完整率較高的稀釋粉稀釋的精液精子活力和畸形率指標也較好；同時頂體的變化晚于活力的變化，而質膜的變化早于活力的變化，這與耿果霞等[30]對精液質膜完整率和活力變化的測定結果相同，與洪潔赟等[8]采用4種不同稀釋粉對稀釋精液的頂體完整率和活力變化研究結果相近。頂體位于精子頭部，較易受損；質膜覆蓋于精子體表，是精子的“盾”，被認為是精子儲存過程中最易受損的部分[24]。侯麗鵬[29]研究發現精子代謝產生的酸性物質會對精子的頂體和質膜造成損傷，若稀釋液不能及時中和酸性物質，就會對精液質量造成極大破壞。而相關研究證實添加β-環糊精[31]、路易波士的提取物[32]、曲酸和雙乙酸鈉[33]等均可以起到保護頂體和膜結構完整性的效果。所以精子頂體和質膜保存效果較好的稀釋粉中可能添加了起到特殊保護作用的物質，保存效果較差的稀釋粉可能因為中和代謝酸的物質不足或效果較差。而精子的頂體和質膜在保存期的某個時段快速下降，推測可能由于部分保護劑含量和效果有限，或ROS積累到一定濃度，從而對精子質膜和頂體產生了集中性破壞造成的。

3.3 各稀釋粉的綜合選擇建議

在許多豬場技術員和配種員觀念中，常溫保存的豬精液有效期只有3～5 d。而本試驗中的中效稀釋粉E、H有效保存時長均超過10 d，且各測定指標表現均較好。通過對一種稀釋粉稀釋精液質量的長期測定，其最適輸精時段可以得到準確把握，配種員應摒棄對豬常溫精液的傳統認識，這將有利于豬場效益的穩定和提升。

本試驗的結果表明，所選9種中效稀釋粉的綜合合格率達88.89%，但企業在選擇稀釋粉時仍應持謹慎態度。本試驗通過測定9種中效稀釋粉對豬精液常溫保存期間pH值、活力、畸形率以及頂體和質膜完整率的變化，發現部分稀釋粉的效果不容樂觀。若有條件，企業可定期對稀釋粉稀釋精液后的多項指標變化情況進行綜合測定，特別是精子畸形率和質膜完整率。通過對稀釋粉稀釋精液常溫保存整體效果的評測，選擇最適稀釋粉，避免單一指標評估降低準確性，可以有效提升豬常溫精液質量，從而更好地提升豬場的效率和效益。