肌原纖維蛋白-殼聚糖可食性膜的制備工藝優化及結構表征

劉琛，靖函之，黃淵，熊善柏，劉茹，杜紅英

華中農業大學食品科學技術學院/國家大宗淡水魚加工技術研發分中心(武漢)，武漢 430070

近年來，化學合成的塑料薄膜在食品包裝中的應用增長迅速，但由于其難降解，會導致“白色污染”等嚴重的環境問題[1]。因此，尋求可生物降解的食品包裝材料是目前研究的熱點之一。生物聚合物由于具有防止香氣成分損失、水分流失、氧氣滲透、可食用與可生物降解等優點，逐漸可替代合成包裝材料[2-3]。

與多糖和脂質膜相比，蛋白膜具有更廣泛的功能特性。我國水產資源豐富，具有良好的開發應用前景，來自淡水魚的肌原纖維蛋白(FMP)是制備可食性蛋白膜的良好原料之一。草魚是我國養殖產量較大的淡水魚，是提取肌原纖維蛋白的較好來源。然而蛋白膜在潮濕環境中機械性能相對較差限制了其應用[4]，因此，需要通過對蛋白質改性以提高其機械性能與阻隔性能。利用殼聚糖(CS)與蛋白質混合增強薄膜的性能是當前蛋白質改性的有效方法之一[5]。殼聚糖具有良好的成膜性、生物相容性、生物降解性、無毒、抗氧化性、抗菌性等優點，可制備成機械性能優良且具有功能特性的薄膜[6-8]。殼聚糖能改善蛋白膜的性能，楊艷玲[9]將殼聚糖與膠原蛋白共混制備復合膜，結果表明隨著殼聚糖含量的增加，共混材料的黏度逐漸減小，吸水率逐漸增加，共混膜的玻璃化轉變溫度比膠原蛋白和殼聚糖的都低，斷面脆性較大；王耀松等[10]將殼聚糖與乳清蛋白共混制備復合膜，結果表明殼聚糖在一定程度上改善了單一膜的性能。利用魚肌原纖維蛋白來源的可食用膜包裝水產品不會影響貯藏樣品的風味特性，且復合膜水蒸氣透過性低，保鮮作用較好并可生物降解。目前有關魚肌原纖維蛋白制備可食性膜的研究報道較少。因此，本研究以肌原纖維蛋白和殼聚糖共混制備可食性膜，并通過單因素試驗及響應面試驗方法優化得到膜制備的最佳工藝條件，為肌原纖維蛋白基的可食性膜的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚，每尾體質量2～3 kg，購自華中農業大學農貿市場。

殼聚糖(分子質量30 ku，脫乙酰度≥85%)，上海晶純試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙酸、甘油，以上試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1750型紫外-可見分光光度計,日本島津公司；Avanti J-26 XP 高速冷凍離心機,美國 Beckman Coulter公司；HR7625食品調理機,中國飛利浦家庭電器有限公司；PB-10 Sartorius標準型pH計,德國賽多利斯股份有限公司；島津X射線衍射儀,島津國際貿易(上海)有限公司；JSM-6390LV掃描顯微鏡系統,日本NTC公司。

1.3 肌原纖維蛋白的提取

參考Fan等[11]的方法提取草魚肌原纖維蛋白，用Lowry法測定肌原纖維蛋白含量。

1.4 肌原纖維蛋白-殼聚糖復合膜的制備

參考Nuanmano等[12]的方法并略作修改，用蒸餾水將提取的肌原纖維蛋白稀釋至2%，用1 mol/L HCl調節pH值至3.0，3 000 r/min離心10 min，收集上清液。使用甘油作為增塑劑，室溫下攪拌30 min。將所得的溶液與2%殼聚糖溶液混合，得到肌原纖維蛋白/殼聚糖復合膜成膜溶液。取40 mL成膜溶液倒入培養皿中，烘箱中干燥16 h，揭膜即得肌原纖維蛋白/殼聚糖復合膜。

此外，各取40 mL 2%肌原纖維蛋白和2%殼聚糖，在工藝優化后的條件下，分別制備肌原纖維蛋白膜、殼聚糖膜與肌原纖維蛋白-殼聚糖復合膜，再進行性能測定。

1.5 單因素試驗

1)干燥溫度的影響。固定甘油質量分數1.5%，成膜材料的肌原纖維蛋白和殼聚糖溶液的體積配比4∶4，改變干燥溫度(30、40、50、60、70 ℃)，按照本文“1.4節”的方法制備復合膜，對膜進行性能測定。

2)甘油含量的影響。固定溫度50 ℃，成膜材料的肌原纖維蛋白和殼聚糖溶液的體積配比4∶4，改變甘油含量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)，按照本文“1.4節”的方法制備復合膜，對膜進行性能測定。

3)成膜材料配比的影響。固定溫度50 ℃，甘油質量分數1.5%，改變成膜材料的肌原纖維蛋白和殼聚糖溶液的體積配比(6∶2、5∶3、4∶4、3∶5、2∶6)，按照本文“1.4節”的方法制備復合膜，對膜進行性能測定。

1.6 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇抗拉強度(Y1)、斷裂伸長率(Y2)和水蒸氣透過性(Y3)為響應值，以溫度(X1)、甘油含量(X2)和成膜材料配比(X3)作為自變量，設計3因素3水平的響應面試驗，因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Response surface design experimentalfactor level and coding

1.7 厚度的測定

采用接觸法測定復合膜的厚度，用數顯千分尺在復合膜表面四角各取1點，中央取1點，共5個點測定膜厚度，取平均值，單位為mm，膜厚用于衡量復合膜的其他性能。

1.8 機械性能的測定

將薄膜裁剪成50 mm×20 mm矩形樣品，置于溫度25 ℃、相對濕度50%的恒溫恒濕箱內平衡12 h，測定其抗拉強度(TS)和斷裂伸長率(EB)，設定探頭測定速率與初始夾距長度分別為2.00 mm/s和30 mm，重復3次，取平均值[13]。

1.9 水蒸氣透過性的測定

根據GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法杯式法》測定水蒸氣透過系數，單位為g/(m·s·Pa)，測定3組數據，取平均值。

1.10 溶解度的測定

將薄膜裁剪成4 cm×4 cm的矩形樣品，105 ℃干燥24 h，得到初始干物質質量Wi。將烘干至恒質量后的薄膜浸入50 mL蒸餾水中。充分吸附24 h后，過濾剩余部分的薄膜。將這些部分干燥至恒質量Wf。

1.11 色度與透光率的測定

用色差計對膜的色度進行測定，記錄色差計顯示的L值、a值和b值。其中，L值代表白度，指樣品的透明情況；a值為正代表樣品偏紅，為負代表樣品偏綠；b值為正代表樣品偏黃，為負代表樣品偏藍。取膜的不同位置進行測定，每個樣品取7個位置進行測定，計算其平均值。

膜的透光率利用紫外-分光光度計測量復合膜在600 nm處的吸光度，每個樣品重復5次。

1.12 水接觸角的測定

膜的表面疏水性在室溫下通過VCA optima XE接觸角測量儀測量水接觸角。將5 μL的蒸餾水滴到薄膜表面，并使用測角儀自動計算接觸角。每個樣品進行5次測量并取平均值。

1.13 X射線衍射光譜測定

使用X射線衍射儀在40 kV的電壓和100 mA的電流下記錄樣品的XRD圖。掃描速率為5 °/min，掃描范圍從10°～35°[14]。

1.14 掃描電子顯微鏡表觀形態觀察

膜的微觀結構采用掃描電子顯微鏡觀察，加速電壓為10 kV，取1 cm×1 cm表面平整均勻的薄膜用于掃描電鏡的觀察[15]。

1.15 數據分析及處理

采用Excel軟件進行數據統計，應用Origin 2018軟件作圖，結果以“平均值±標準差”表示，在a=0.05水平進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 干燥溫度對復合膜性能的影響

如表2所示，隨著干燥溫度的升高，復合膜的厚度有所降低，抗拉強度逐漸增加，斷裂伸長率降低，水蒸氣透過率和溶解度均降低。此外，干燥溫度對復合膜的色澤有一定影響，如表3所示，隨著溫度的升高，復合膜的L值降低且透光率降低，表明薄膜顏色變暗，a值和b值的增加表明膜的顏色趨于更紅和更黃。綜上所述，干燥溫度為50 ℃時，復合膜綜合性能最佳。

表2 不同干燥溫度條件下復合膜性能Table 2 Film properties at different temperature

表3 干燥溫度對復合膜色度的影響Table 3 Effects of temperature on the color of the composite films

2.2 甘油含量對復合膜性能的影響

如表4所示，隨著甘油含量的增加，復合膜的厚度略有增加,抗拉強度降低，斷裂伸長率增加,水蒸氣透過性和溶解度均增加。如表5所示，甘油含量對復合膜的色澤和透光率幾乎沒有影響，這是由于甘油本身無色透明且具有良好的相容性。綜上所述，甘油質量分數為1.5%時，復合膜綜合性能最佳。

表4 不同甘油含量下的復合膜性能Table 4 Film properties at different glycerin concentrations

表5 甘油含量對復合膜色度的影響Table 5 The effect of glycerin concentration on the color of composite films

2.3 成膜材料配比對復合膜性能的影響

復合膜的性能與基質的類別和含量密切相關。如表6所示，隨著殼聚糖占比的增加，復合膜厚度增加，抗拉強度處于先上升后略微下降的趨勢，而斷裂伸長率逐漸降低。當FMP∶CS為4∶4時，薄膜的抗拉強度最大，水蒸氣透過性呈先降低后升高趨勢，溶解度增加。如表7所示，隨著成膜材料配比中殼聚糖占比的增加，L值越低，表明薄膜變暗，a值和b值的增加表明膜的顏色明顯更紅和更黃。這可能是由于殼聚糖溶液的顏色偏黃，所以隨著殼聚糖溶液的增多，薄膜顏色明顯改變。這一變化與薄膜透光率降低的表現相一致。綜上所述，肌原纖維蛋白和殼聚糖體積比為 4∶4時，最適宜制備復合膜。

表6 成膜材料不同配比下的復合膜性能Table 6 Film properties under different ratios of film-forming materials

表7 成膜材料不同配比對復合膜色度的影響Table 7 Effect of films-forming material ratio on color of composite films

2.4 響應面試驗設計與結果

由單因素試驗結果分析可知，成膜材料配比(FMP∶CS)、甘油含量、干燥溫度對可食膜的機械性能、水蒸氣透過性均有顯著影響，故以溫度(X1)、甘油含量(X2)、成膜材料配比(X3)為試驗因素，以抗拉強度(Y1)、斷裂伸長率(Y2)、水蒸氣透過性(Y3)為響應值，建立響應面優化試驗，試驗結果見表8。

表8 響應面試驗設計及結果Table 8 Variance analysis of response surface test

利用Design-Expert軟件對表8中的試驗數據進行回歸擬合，建立回歸模型與顯著性分析，獲得復合膜的3個性能指標的回歸方程，如表9所示。

由表9可見，3個響應值的回歸模型均極顯著(P<0.000 1)，且3個模型的失擬項均大于0.05，這表明3個模型失擬項不顯著，能較好地描述試驗結果。3個回歸模型的決定系數R2分別為0.988 2、0.995 1、0.999 3，這表明該模型擬合度較好，同時，這3個模型均具有較低的離散系數(CV=1.91%、1.96%、0.98%)，說明整個試驗具有較好的精確度和可靠性。

表9 各因素對肌原纖維蛋白-殼聚糖復合膜性能影響的最佳擬合方程表Table 9 The best fitting equations for the influence of various factors on the performanceof myofibrillar protein/chitosan composite films

采用Design-Expert軟件，得出最佳的制膜工藝為：溫度為55.24 ℃、甘油含量為1.63%、成膜材料配比為4.33∶3.67，此時通過模型預測可食膜的抗拉強度為6.26 MPa，斷裂伸長率為69.79%，水蒸氣透過性為1.46×10-11g/(m·s·Pa)。為了保證進一步試驗結果的準確性，對預測結果進行了驗證，為了便于實際操作，取溫度55 ℃，甘油質量分數1.6%，成膜材料配比4.3∶3.7，此條件下對預測結果進行驗證。驗證試驗結果為：抗拉強度6.21 MPa，抗拉強度為68.67%，水蒸氣透過性為1.43×10-11g/(m·s·Pa)。與預測結果相近，說明試驗結果可用。

2.7 水接觸角

在食品包裝中，潤濕性是較為常見的特性，可進行水接觸角測定以衡量薄膜的親水/疏水性。如圖1所示，所有薄膜的接觸角均小于90°，表明這3種薄膜均有一定的親水性。CS膜的接觸角最低，這表明CS膜的親水性最高，FMP/CS復合膜的接觸角高于CS膜，這表明FMP/CS復合后能在一定程度上降低CS膜的高親水性，從而對水蒸汽阻隔性起到改善作用。

圖1 不同類型薄膜的水接觸角Fig.1 Water contact angle of different types of films

2.6 X射線衍射分析

為了對FMP膜、CS膜與FMP/CS復合膜的晶體結構進行初步探究，進行了X射線衍射分析。如圖2所示，FMP膜在2θ=10°與2θ=21°出現衍射峰，CS具有無定形的結構，在2θ=21°左右處有較寬的單峰出現。FMP/CS復合膜在2θ=21°出現衍射峰，且衍射峰強度最低，與FMP膜相比，2θ=10°處的峰消失，這是與分子間氫鍵以及復合膜的有序結構形成有關，表明FMP與CS成膜基材的混溶性良好。

圖2 不同類型薄膜的X射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction patterns of different types of films

2.7 掃描電子顯微鏡下復合膜形態結構分析

薄膜的內部微觀結構取決于不同薄膜組分的相容性與相互作用，這會直接影響薄膜的機械性能與阻隔性能。圖3顯示了3種薄膜的表面與截面形態圖。從表面形態圖可以看出，FMP薄膜表面有少許“突起”，整體相對光滑；CS膜與FMP/CS膜表面均光滑均勻，沒有孔或裂紋，這表明薄膜均形成了有序基質，肌原纖維蛋白、殼聚糖、甘油三者間的相容性良好。從截面形態圖可以看出，FMP截面有些許小孔，結合水接觸角與水蒸氣透過性的結果來看，雖然FMP膜的親水性較低，薄膜卻仍然有著較高的水蒸氣透過性，這可能由于薄膜內部小孔的存在，促進了水分子的擴散。FMP/CS復合膜的橫截面較致密，幾乎沒有小孔，這可能是由于肌原纖維蛋白與殼聚糖分子的氫鍵相互作用有關。

1.FMP膜; B.CS膜; C.FMP/CS復合膜。A. Myofibrillar protein film; B. Chitosan film; C.Myofibrillar protein/chitosan composite film.

3 討 論

以草魚肌原纖維蛋白-殼聚糖為成膜基質，甘油為增塑劑制備復合膜，通過響應面試驗優化方法得到了具有良好機械性能與水蒸氣阻隔性能薄膜的最佳工藝配方。結果表明，干燥溫度、甘油含量、肌原纖維蛋白與殼聚糖配比均對復合膜性能影響顯著，不同條件間的交互作用對復合膜的性能有著顯著影響。

當干燥溫度較低時，水分蒸發速率較慢，干燥所需時間較長，導致復合膜基質形成非晶區，促進了分子內部重排和親水基團的殘留[16]，聚合物網絡會吸收更多的水并溶脹，復合膜厚度增加。此外，水分會起到一定的增塑作用，從而使得復合膜的抗拉強度較低。相反，較高的溫度有利于氨基酸基團舒展，并產生了更開放的結構，提高了肌原纖維蛋白與殼聚糖分子的運動速率，促進了蛋白質與殼聚糖分子之間的交聯，使得膜結構趨于致密，剛性增強，斷裂伸長率降低。水蒸氣透過性和水分含量密切相關，一般而言，水分含量越多，水蒸氣透過性越大。由于溫度升高可以促進肌原纖維蛋白與殼聚糖分子之間的美拉德反應，使水溶性與透光率降低且隨著溫度的升高，水分活度逐漸趨于美拉德反應的最適水分活度。此外，隨著美拉德反應程度的增大，使可食性膜的顏色加深，這一變化與透光率降低的原因相一致。

由于甘油是親水性小分子，可以在大分子網絡中起到填充作用，隨著甘油含量的增加，膜的水蒸氣透過性呈現先減少后增大的趨勢。高含量的甘油破壞了分子鏈之間的相互作用，這導致分子鏈間距增加并形成較松散的網絡，使肌原纖維蛋白-殼聚糖基質中引入了更多的自由體積，導致了復合膜變厚且增加了薄膜的透濕性。此外，薄膜溶解度顯著增大，透光率幾乎不變。這可能是由于甘油是親水性分子，過多的甘油會從薄膜內部溢出。

成膜基質對薄膜機械性能的影響可能是殼聚糖和肌原纖維蛋白的結合位點有限，殼聚糖占比增加到一定程度時，二者的結合趨向飽和，使抗拉強度增大，殼聚糖占比繼續增加時，抗拉強度并未明顯增加，這可能是殼聚糖含量過多，復合膜的厚度有所增加，且作用位點并未增加，使二者無法充分結合。而斷裂伸長率的降低是由于隨著殼聚糖含量的增加分子間的作用力由殼聚糖主導。綜上所述，復合膜很好地改善單一肌原纖維蛋白膜機械性能差的缺點。此外，當肌原纖維蛋白分子較多時，多余的分子以游離的形式存在，水蒸氣透過性較高，當二者比例合適時，2種分子充分結合，填充在各自的網絡結構中，使得復合膜結構緊密。

此外，水接觸角、X射線衍射圖與掃描電鏡圖結果均表明，肌原纖維蛋白分子與殼聚糖分子混合后可以改善可食性膜親水性高的劣勢，且肌原纖維蛋白分子與殼聚糖分子間的相容性良好。