94份小麥育種親本的功能基因分子檢測

李瑋，宋國琦，商航，李玉蓮，張淑娟，張榮志，李吉虎，高潔，李根英

（1.山東省農業科學院作物研究所／農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.新疆農業大學科學技術學院，新疆 烏魯木齊 830052）

小麥是復雜的異源六倍體物種，其基因組約為17 Gb［1］，是水稻的36倍多、玉米的7倍多。巨大的基因組給基因克隆和基因功能分析帶來重重困難，是導致小麥分子育種滯后于水稻和玉米的原因之一。2012年Liu等［2］系統總結了小麥中已克隆的30多個功能基因或遺傳位點及其相關的97個功能標記，主要涉及小麥加工品質、農藝性狀和抗病性。功能標記是根據功能基因上的等位變異開發的分子標記，不同于連鎖標記，不會因為染色體交換導致標記與表型不符，是用于分子標記輔助選擇的理想標記。這97個功能標記主要為STS、SCAR和CAPS，需要通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，較為費時費力。2016年Rasheed等［3］報道了70個小麥KASP功能標記，相比需要通過凝膠電泳進行檢測的分子標記，通過熒光檢測的KASP標記檢測速度提高了45倍。2017年國際小麥基因組測序聯盟提前釋放了中國春參考基因組序列，為小麥功能基因研究鋪平了道路。2019年Khalid等［4］報道了小麥中已克隆功能基因或遺傳位點增加到87個，對應的KASP標記數量也增加到124個。隨著越來越多的KASP功能標記被開發，功能標記也逐漸被應用。2019年Zhao等［5］對來自全球的1 152份小麥材料進行了47個基因的KASP標記檢測分析，粒重、抗旱、黃色素、穗發芽和株高相關的幾個基因優異等位變異占比較高，而抗病相關的Lr68、Fhb1、Yr15和品質相關的Wx-B1優異等位變異占比較低，可作為未來改良的目標。2020年單子龍等［6］利用22個品質相關的KASP功能標記對153份河北省歷年審定的小麥品種進行了檢測，僅有5個基因的優異等位變異占比超過60%，7個基因的優異等位變異占比低于10%，表明通過輔助選擇優異等位變異改良河北省小麥品質性狀仍有力可為。2020年王志偉等利用抗病［7］、株高和粒重［8］相關的KASP標記對云南省42份小麥品種（系）進行了檢測，絕大部分基因的優異等位變異占比較低，仍有遺傳改良潛力。2021年Zhang等［9］對寧夏自治區種植的小麥地方品種、現代品種（系）和引進品種共207份進行了44個KASP標記檢測，與粒重、硬度、黃色素、株高等相關的幾個基因優異等位變異占比較高，其他大部分基因的優異等位變異占比有待提高。

現代育種技術已經從傳統經驗育種向精準育種轉變，通過提高與育種目標相關功能基因優異等位變異的占比可以促進育種基礎的提高，功能基因的分子標記輔助選擇對小麥分子育種意義重大。山東省是我國小麥生產大省，為了促進小麥分子育種技術在山東的發展和應用，了解山東省小麥優異等位變異占比情況，本研究從課題組保存的小麥育種親本出發，選擇部分分型效果較好的KASP功能標記進行檢測，旨在明確功能基因優異等位變異在育種親本材料中的占比，促進山東省小麥育種單位利用小麥分子標記輔助選擇進行遺傳改良。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用的小麥材料（表1）是本課題組收集保存用于育種的小麥品種或高代品系，共94份。2019年11月播種于山東省農業科學院作物研究所濟南試驗基地。播種機點播，行距33 cm，行長2 m，株距5 cm，按行長劃排，排間留1 m的田間走道。

1.2 DNA提取

于小麥抽穗期取2 cm左右旗葉，液氮冷凍，用Geno／Grinder 2010組織研磨機（SPEX，美國）進行研磨，800 r／min研磨20 s。用快捷型植物基因組DNA提取系統［天根生化科技（北京）有限公司］提取DNA，去離子水溶解，調整濃度至100 ng／μL。

1.3 KASP標記檢測

KASP反應體系和反應程序均參考Rasheed等［3］的，所用42個KASP標記引物序列來自Rasheed［3］、Khalid［4］和高潔［10］等，引物由青島擎科生物技術有限公司合成。KASP Master Mix購自LGC公司（北京）。使用PHERAstar SNP分型檢測儀（LGC，英國）檢測KASP反應最終熒光顏色，檢測結果導入Kluster Caller軟件進行分型。基因名稱和相應基因標記名稱見表2。

表1 參試小麥品種（系）

表2 基因名稱和相應基因標記名稱

2 結果與分析

2.1 KASP標記檢測效果

本研究共檢測了42個KASP標記，基本上所有標記都能較好地分型（圖1）。除TaGS2B1＿1936檢測缺失數據為15個外，其余標記的缺失數據均較少（圖2），平均每個標記的缺失數據個數為2.4。基因的優異等位變異占比從0至100%，優異等位變異占比低于10%的有7個基因，高于80%的有11個。

圖1 部分KASP標記檢測結果

圖2 94份小麥材料的等位變異占比

2.2 1B／1R易位檢測結果

選擇1RS∶1BL＿6110檢測1B/1R易位，94份參試小麥材料中28份含有1B/1R易位，占比30%。1RS染色體同時含有抗病基因和不利品質的黑麥堿基因，在本研究中將含有1B/1R易位列入優異等位變異。含有優異等位變異的材料有魯原502、周麥22、周8425B、北京841、濮麥053、內鄉188、HM-1、濟寧12、西農511、周麥36、周麥38、JM268、德05-10、華麥1號、寧麥11、淮麥20、寧 洪17237、17J218、17J236、JN331、科 農3106、菏麥0662、菏麥0746-2、漯抗2號、K35、山農0713-2、山農多粒1號、山融3號。

2.3 株高相關標記檢測結果

對Rht-B1和Rht-D1兩個株高基因進行了KASP標記檢測，分別有17份和75份材料含有矮稈等位變異，占比為18%和80%。同時含有兩個矮稈基因的有3份材料，分別是豫麥47、周8425B和金麥1號。不含上述兩個矮稈基因的材料是京411和北京841。

2.4 產量相關標記檢測結果

檢測了9個產量相關的KASP標記。千粒重相關的TaCwi、GW2-6B-721SNP和Sus1-7B-2932IND優異等位變異占比較高，分別是89%、100%和94%，而TaGS2B1＿1936、GS5-2334、TaGW2-6A優異等位變異占比較低，分別是33%、44%和23%；TaGASR是粒長的KASP標記，優異等位變異占比為10%；TEF7A1＿606是小穗粒數的KASP標記，優異等位變異占比38%；TaMoc-2433是穗數的KASP標記，優異等位變異占比僅為5%。參試小麥材料中，山融3號含有除TaMoc-2433外的8個優異等位變異，是含有產量相關優異等位變異最多的材料；其次是山農9540-55，含有除TaMoc-2433和TEF7A1＿606的7個優異等位變異。同時含有TaMoc-2433和TEF7A1＿606優異等位基因的材料有西農511和科農3106。

2.5 品質相關標記檢測結果

檢測了9個與品質相關的KASP標記。GluA1.1＿1883和GluD1＿4777是高分子量麥谷蛋白亞基2*／1和（5＋10）標記，分別占68%和28%，參試小麥材料中濟麥20、鄭麥366、冀師02-1、洲元9369、藁優5766、煙農1212、煙農999、HM-1、硬B2 16-6、濟寧12、濟麥229、濟麥44、中麥578、新麥9、華麥1號、寧麥11、漯抗2號、山農0538、山農24、山農25同時含有優異亞基2*／1和（5＋10）；脂肪氧化酶標記LoxB1＿SNP的低酶活優異等位基因占比70%，含有脂肪氧化酶優異等位變異的材料較多；與硬度相關的Pina-D1＿INS、Pinb2-v2-3和Pinb-D1＿INS的優異等位變異占比分別為5%、51%和72%，一般小麥中硬度優異等位變異僅含Pina-D1和Pinb-D1其中一個，本研究中含有Pina-D1優異等位變異的材料較少，冀師02-1、Manital和藁優5766同時含有Pina-D1和Pinb2-V優異等位變異；與黃色素相關的Zds-A1＿SNP、ZDS-D1＿SNP和Pds-B1＿2002的優異等位變異占比分別為26%、99%和22%，同時含有三個黃色素優異等位變異的材料有新麥26、內鄉188、濟寧12和山農29。

2.6 抗性相關標記檢測結果

檢測了12個與抗性相關的KASP標記。抗赤霉病的Fhb1的snp3BS-8檢測陽性材料僅有山農抗赤1號，占比1%；抗小麥黃花葉病的Sbmp＿6061檢測陽性占比5%，有煙農19、硬B2 16-6、濟糯麥1號、漯抗1號和山農25；未檢測到Pm21陽性材料；抗葉銹的ubw14和Lr68-2檢測陽性占比分別是50%和15%，兼抗條銹、葉銹和白粉的多效抗病基因標記C6K2C1、Sr2K3和Lr46g22K3檢測陽性占比分別是0、0和93%，ubw14、Lr68-2和Lr46g22K3均為陽性的材料有京411、北京841、陜7859、煙農1212、煙農999、濟寧12、濟麥60、西農511、德05-10、華麥1號、淮麥20、17J218、山融3號；抗旱的1fehw3檢測陽性材料占比66%，含有該基因的材料較多；抗穗發芽的TaSdr-B1和PHS1-prom-222優異等位變異占比分別為21%和51%，Vp1B1有a、b、c三個等位變異，等位變異a不抗穗發芽，等位變異b和c抗穗發芽，Vp1B2-83不能區分a和b，故本研究中將c作為優異等位變異，占比51%，同時含有Vp1B2-83和PHS1-prom-222優異等位變異的材料有洲元9369和華麥1號，同時含有TaSdr-B1和Vp1B2-83優異等位變異的材料有陜7859、藁優5766、內鄉188、中麥578、寧麥11、科農3106、漯抗1號、漯抗2號、K35、山農0538、山農抗赤1號、山農特大粒1號、山融3號。

2.7 春化、光周期相關標記檢測結果

檢測了6個與春化、光周期相關的KASP標記。光周期標記GS105-1117IND、TaPpdBJ001和TaPpdDD001優異等位變異占比分別為99%、73%和98%；春化基因標記Exon7＿C／T＿Vrn-A1、Vrn-B1＿B、Vrn-D1-D1a＿A優異等位變異占比分別為85%、96%和80%。光周期和春化基因決定了小麥的生態適應性，因此相同生態區的小麥主效基因的等位變異基本上是一致的且占比很高。

2.8 開花期相關標記的檢測結果

檢測了3個與開花期相關的KASP標記。開花期的優異等位變異與生態區有關，本研究中將檢測數量較多的等位變異作為優異等位變異。TaFT3-B1、TaELF3-B1和PRR73A1-9IND優異等位變異的占比分別為67%、98%和81%。

3 討論與結論

1B／1R易位系小麥品種具有適應性好、耐后期高溫、高產穩產等優點［11］，這主要得益于1RS染色體上攜帶有Lr26、Sr31、Yr9和Pm8等抗病基因和其他高產穩產基因或基因組合［12］。1B／1R易位系被作為優異親本廣泛利用，是外源基因用于小麥品種改良最成功的范例［13］，選擇是否攜帶1RS染色體最簡便有效的方法就是分子標記輔助選擇。近期，Qi等［14］提出了作物育種“布達拉”模型，首先將品種的優良性狀和優異基因定向聚集，這就需要通過功能標記輔助選擇來實現。小麥中已經克隆的功能基因相對較少，如何利用功能標記輔助選擇將這些已克隆的功能基因用于育種是當務之急。雖然國內有關親本基因型檢測的報道不少，但利用功能標記輔助選擇成功選育小麥品種還鮮有報道。加強對現有功能標記的利用，特別是育種親本中占比較低的優異等位變異的利用對小麥改良有重要意義。本研究中與產量相關 的KASP標 記TaGASR、TaMoc-2433、TaGS2B1＿1936、GS5-2334、TaGW2-6A，與品質相關的KASP標記GluD1＿4777、Zds-A1＿SNP、Pds-B1＿2002，與抗性相關的KASP標記snp3BS-8、Sbmp＿6061、Lr68-2、C6K2C1、Sr2K3、TaSdr-B1在檢測的94份材料中優異等位變異占比均較低，可作為未來小麥分子育種應用的重要方向。

SNP是基因組中最豐富的變異類型，是未來分子標記利用的方向，隨著越來越多功能基因被克隆，KASP功能標記數量也會逐步增加。KASP是檢測SNP最簡便靈活的技術，已被廣泛應用。除LGC公司專用的檢測儀器外，熒光定量PCR儀、熒光酶標儀等均可用于檢測KASP標記。2019年KASP功能標記數量已達124個［4］，Zhao［5］、Zhang［9］等 分 別 選 擇 了47個 和44個KASP標記，本研究選用了42個標記，這是因為小麥基因組的復雜性導致將SNP轉化成KASP標記相對比較困難［15］。已開發的KASP標記可能還存在假陽性等問題［3］，部分KASP標記的檢測結果不盡如人意，隨著KASP標記開發和應用的成熟，這些問題都有望得到解決［10，15］。