小偃麥滲入系苗期耐鹽鑒定與分子標記評價

喬麟軼，張瀟文，李世姣，陳芳，李欣，郭慧娟，張樹偉，常利芳，張曉軍，暢志堅

（1.山西農業大學農學院／作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031；2.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006）

土壤鹽漬化嚴重影響作物的正常生長和產量。目前我國東北、西北、黃河三角洲及沿海等地區的鹽漬化土壤面積高達3.6×107hm2［1，2］，已成為限制作物增產的主要因素之一。小麥是我國的主糧作物，隨著人口增長對糧食需求的不斷加大，增強小麥對鹽漬土壤的耐受性進而提高其產量，對于保障國家的糧食安全意義重大。

廣泛發掘耐鹽種質是選育小麥耐鹽品種的前提。偃麥草屬 （Thinopyrum）植物隸屬禾本科小麥族，可在鹽堿地或灘涂生長，是小麥抗逆性改良的優異基因庫［3］。長期以來，育種家通過遠緣雜交或體細胞融合技術將偃麥草遺傳片段導入小麥，創制了小偃麥種質，并據此選育出耐鹽品種用于生產［3-5］。例如源自中間偃麥草 （Th.intermedium）的山農120211［6］和源自長穗偃麥草 （Th.ponticum）的小偃6號［7］、山融3號［8］都表現出很好的耐鹽性。其中，山融3號攜帶的耐鹽基因被定位在5A染色體上［9，10］。

本實驗室自1986年起利用染色體異源重組將中間偃麥草片段轉移至普通小麥，創制了TAI7045、TAI7047和TAI8335等多個八倍體小偃麥新類型［11-13］，并將其與普通小麥品種雜交、回交，獲得一批兼抗小麥白粉病和條銹病的小偃麥新種質［14，15］。本研究從小偃麥TAI7047的后代滲入系中選出136份染色體數目為42的材料進行苗期耐鹽性鑒定，并利用分子標記對其進行評價，以期為小麥耐鹽育種提供新種質及耐鹽新抗源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

136份小偃麥滲入系 （晉麥33／TAI7047／／*2京411的F9～F10家系）及其親本用于苗期耐鹽鑒定，小麥品種山融3號和中國春分別作為耐鹽和鹽敏感對照材料。其中，山融3號由山東省農業科學院作物研究所劉成研究員提供，其余材料均由作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室提供。

1.2 鹽脅迫處理

每份材料取25粒種子，先用1%的雙氧水消毒，再用蒸餾水沖洗干凈，然后放置于培養皿中萌發。待胚根伸長至2～3 cm時，選擇16粒生長勢一致的種子轉移到培養箱中的1／2霍格蘭氏營養液中生長，參數設置為16 h光照／8 h黑暗、22℃／16℃；待幼苗生長至兩葉一心期時更換含NaCl的1／2霍格蘭氏營養液進行鹽脅迫，再生長7 d進行表型鑒定。試驗設3次重復。

預試驗設置0、50、100、150、200、250、300、350 mmol／L NaCl共8個濃度對耐鹽對照山融3號和鹽敏感對照中國春進行苗期耐鹽鑒定，選擇兩者耐鹽表型差異最大時的處理濃度來鑒定滲入系材料。

1.3 表型鑒定與數據分析

參考單雷等［9］的方法，根據農業農村部《小麥耐鹽性鑒定評價技術規范》（NYΠPZT0012.2002）將小麥耐鹽級別劃分為0～4級，對每個材料的16株幼苗分別進行小麥葉片的鹽害程度鑒定，并計算鹽害指數。計算方法為：鹽害指數（%）＝∑（0×0級苗數＋1×1級苗數＋2×2級苗數＋3×3級苗數 ＋4×4級苗數）×100／（5×16）。

根據鹽害指數評價材料耐鹽性，評價標準為：高耐（0～20.0%），耐鹽 （20.1%～40.0%），中耐（40.1%～60.0%），敏感 （60.1%～80.0%）和高感 （80.1%～100.0%）。

采用Microsoft Excel 2007軟件處理數據、作圖以及數據統計分析。

1.4 分子標記檢測

采用改良CTAB法［16］提取供試材料及對照品種的基因組DNA。利用山融3號耐鹽基因的連鎖分子標記Xbarc144（F：5′-GCGTTTTAGGTGGACGACATAGATAGA-3′；R：5′-GCGCCACGGGCATTTCTCATAC-3′）［10］對小偃麥滲入系進行PCR鑒定。PCR反應體系為10μL：ddH2O 3.5μL，PCR Mixture 5.0μL（B532061，生工生物，中國上海），引物0.5μL，DNA模板 （100 ng／μL）1.0μL。PCR擴增程序：95℃預變性3min；95℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸10 min，12℃保存。PCR擴增產物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis＝29∶1）電泳檢測，硝酸銀染色后照相保存結果。

2 結果與分析

2.1 苗期耐鹽鑒定濃度篩選

以耐鹽對照山融3號和鹽敏感對照中國春為測試材料，設置0～350 mmol／L NaCl共8個濃度進行苗期耐鹽鑒定。結果（圖1）顯示，隨著NaCl濃度的增加，測試材料的鹽害指數逐漸增加。在250 mmol／L NaCl濃度下，山融3號和中國春的鹽害指數分別為35.4%和73.6%，差異達到最大值，因此將250 mmol／L作為對滲入系材料進行耐鹽篩選的鑒定濃度。

圖1 小麥苗期耐鹽鑒定濃度的篩選

2.2 滲入系材料苗期耐鹽鑒定

對136份小偃麥滲入系及其親本進行苗期耐鹽評價。結果顯示，外源親本TAI7047的鹽害指數為29.26%，具有耐鹽性；而小麥親本晉麥33和京411則表現為鹽敏感，鹽害指數分別為63.17%和70.83%。小偃麥滲入系中，耐鹽、中耐、敏感、高感材料的數量分別為9（6.6%）、62（45.6%）、62（45.6%）和3（2.2%）份，其中，有6份滲入系（CH01、CH1631、CH1696、CH1715、CH3286和CH16425）的鹽害指數低于對照品種山融3號，表現出很好的耐鹽性（圖2，表1）。

2.3 苗期耐鹽滲入系的分子標記評價

利用山融3號的耐鹽基因連鎖標記Xbarc144對136份小偃麥滲入系及其親本進行PCR鑒定。結果顯示，Xbarc144在鹽敏感小麥親本晉麥33、京411和耐鹽親本TAI7047間存在多態性，并在小偃麥滲入系中表現出4種標記型，其中Xbarc144-a和Xbarc144-b型分別來自于晉麥33和京411，Xbarc144-c和Xbarc144-d型則來自于TAI7047（圖3）。然而方差分析結果 （表2、表3）顯示，4種標記型對應的鹽害指數之間無明顯差異 （F＝0.27＜F0.05），表明Xbarc144標記與這批滲入系的耐鹽表型不連鎖。

圖2 136份小偃麥滲入系的苗期耐鹽等級和分布

表1 6份耐鹽滲入系及其親本和對照材料的苗期耐鹽表型和標記型

表2 Xbarc144在136份小偃麥滲入系中的4種標記型對應鹽害指數

表3 Xbarc144的4種標記型對應表型值的方差分析

圖3 Xbarc144標記在部分小偃麥滲入系及其親本中的標記型

3 討論

育種家通常將高產、優質和抗病等性狀作為主要育種目標，對耐鹽等抗逆表型的關注相對較少。有研究表明，現代小麥品種的整體耐鹽性幾乎沒有提升，而遺傳多樣性持續下降，優異耐鹽單倍型較為單一［7］。因此，從小麥近緣物種中廣泛發 掘 耐 鹽 位 點 尤 為 重 要。 例 如Byrt［17］和Munns［18］等從一粒小麥 （Triticum monococcum）的漸滲系中鑒定出一個主效耐鹽位點Nax2，并確定TmHKT1；5為候選基因，導入TmHKT1；5-A的四倍體小麥在鹽堿地中增產達25%。而偃麥草屬鹽生植物含有更為豐富的耐鹽基因，本實驗室歷經30余年將中間偃麥草片段導入小麥，創制了一大批小偃麥滲入系。本研究對八倍體小偃麥TAI7047的滲入系進行苗期耐鹽鑒定，共篩選出71份耐鹽材料，其中有6份材料的耐鹽性高于對照品種山融3號，可為小麥耐鹽遺傳改良提供新種質及耐鹽新抗源。

鑒定結果顯示，這批滲入系的小麥親本晉麥33和京411均為鹽敏感材料，而親本八倍體小偃麥TAI7047則表現為耐鹽，表明耐鹽性來源于TAI7047。TAI7047中導入了中間偃麥草的2條J染色體、6條Js染色體、3條St染色體和2條Js-St染色體［12，19］，初步猜測其耐鹽性可能來源于中間偃麥草，對此我們將檢測TAI7047系譜親本的苗期耐鹽表型進行驗證。

由于小麥耐鹽品種山融3號的耐鹽基因來源于長穗偃麥草，而中間偃麥草（JJsSt）與長穗偃麥草 （JJsJx）具有相似的基因組組成［20］，因此我們用山融3號耐鹽基因的連鎖標記Xbarc144對小偃麥滲入系進行PCR鑒定，結果顯示滲入系的耐鹽表型與Xbarc144不連鎖，可能包含新的耐鹽位點，這將有助于拓寬小麥的遺傳背景。

4 結論

利用250 mmol／L NaCl對136份小偃麥滲入系進行苗期耐鹽鑒定，從中選出71份耐鹽材料，其抗性來自于親本TAI7047。有6份滲入系的耐鹽性（鹽害指數31.25%～35.94%）略高于對照品種山融3號 （鹽害指數38.45%），可為小麥耐鹽遺傳改良提供新種質。本研究中滲入系耐鹽表型與山融3號的耐鹽連鎖標記Xbarc144不連鎖，可能具有新的耐鹽位點，拓寬了小麥的耐鹽遺傳背景。