粗穗披堿草1HtS染色體臂特異標記開發

王暉，郭軍，周寶元，汪曉璐，韓冉，徐文競，劉愛峰，李豪圣，劉成，劉建軍

（1.山東省農業科學院作物研究所／農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.中國農業科學院作物科學研究所／農業部作物生理生態與栽培重點開放實驗室，北京 100081）

小麥（Triticum aestivum L.）是世界上的主要糧食作物之一，其生產水平直接影響著國家糧食安全。我國小麥條銹病和葉銹病發病面積大，常常造成小麥嚴重減產甚至絕收。近年來由于全球氣候變暖，小麥銹病在我國有加重趨勢［1］，因此培育和推廣抗病小麥品種成為最經濟有效且綠色環保的防控措施。長期以來，科學家們一直致力于抗病資源發掘和優異抗病育種材料創制等研究，也獲得了一批優異抗病資源［2，3］。然而由于致病生理小種的變異導致獲得抗病資源的抗性逐漸喪失［4，5］。小麥近緣植物中含有豐富的抗病、抗逆和抗蟲等基因，是小麥育種的優異基因源。通過遠緣雜交可以將近緣植物的優異基因轉移給小麥，創制小麥-近緣植物異染色體系。這些含小麥近緣植物血緣的異染色體系是拓寬小麥遺傳基礎、抵御小麥重要病蟲害、增加小麥產量和提升小麥品質的重要物質基礎［6］。

粗穗披堿草（Elymus trachycaulus，2n＝4x＝28，基因組為StStHtHt）是披堿草屬一個具有優異抗性的物種，高抗大麥黃矮病［7］、小麥白粉病［8］、葉銹病［9，10］和稈銹病［11］。Sharma和Gill于1983年開展了粗穗披堿草種質導入小麥研究，通過胚拯救獲得了一批小麥-粗穗披堿草遠緣雜交材料［12］。1988—1996年 間，Gill［13］、Morris［7］和Jiang［14］等分別從這些雜交后代材料中篩選并鑒定出了小麥-粗穗披堿草附加系、代換系、易位系和端體系等材料。2005年，Friebe等［8］對小麥-粗穗披堿草羅伯遜易位系1HtS·1BL進行研究，命名了抗葉銹基因Lr55。2013年，劉成［15］和宮文萍［11］等的研究發現，該易位系不僅同時近免疫美國和中國的葉銹菌小種，還近免疫我國西南麥區流行的條銹菌混合小種。因此，該易位系是不可多得的兼抗型材料。

內含子是真核生物基因在轉錄形成成熟RNA過程中，由蛋白質-RNA復合體識別并剪切掉的非編碼基因組序列，其內部存在各種各樣潛在內含子多態性（potential intron polymorphism，PIP）。Yang等［16］在大麥、高粱、大豆和棉花等59個物種中開發了57 658個PIP標記，并建立了PIP標 記 數 據 庫 （http://ibi.zju.edu.cn／pgl／pip／）。在有差異的內含子兩側的外顯子序列上設計引物，利用PCR擴增出內含子序列的片段進行多態性檢測，稱為內含子長度多態性（intron length polymorphism，ILP）［17］。ILP標記具有基因特異性、共顯性、高變且遺傳穩定、豐度高等特點，可用于分子輔助育種。研究表明，外顯子-內含子結構在不同物種的同源基因中基本上是保守的［18］。因此，這使得在沒有參考基因組的物種中開發ILP標記成為可能。截至目前，粗穗披堿草中尚未有ILP標記的相關報道。基于此，本研究以小麥-粗穗披堿草1HtS·1BL易位系與中國春ph1b基因缺失突變體雜交回交后代等材料進行分子標記篩選和驗證，開發了粗穗披堿草1HtS特異的ILP標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料列于表1。其中，序號1～21的材料由美國堪薩斯州立大學Friebe教授提供；綿陽11和安岳排燈麥由電子科技大學楊足君教授提供；光頭小麥由四川農業大學王益教授提供；TA5072／CS ph1b BC1F2材料為中國春-粗穗披堿草1HtS·1BL羅伯遜易位系TA5072（以下簡稱1HtS·1BL易位系）與中國春ph1b基因缺失突變體的BC1F1后代材料。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組總DNA提取 供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取。取葉片約100 mg放入2 mL離心管（提前加入直徑2 mm的鋼珠）中，液氮中速凍，然后用SCIENTZ-192組織研磨機在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末，加入緩沖液FP1 400μL和Tnase 6μL，渦旋振蕩1 min，室溫放置10 min；然后加入緩沖液FP2 130 μL，輕輕混勻，渦旋振蕩1 min，12 000 r／min離心5 min，將上清轉移至新的離心管中；向上清液中加入70%體積的異丙醇，充分混勻，12 000 r／min離心2 min，棄上清，保留沉淀；加入70%的乙醇500μL洗滌DNA，12 000 r／min離心2 min，棄上清，再次用70%的乙醇500μL洗滌一次，步驟與第一次的相同。晾干后，加入ddH2O把DNA溶解成100μL原液，檢測提取DNA的純度和濃度，并用ddH2O將DNA原液稀釋到25 ng／μL，作為進行PCR的模板DNA。

1.2.2 染色體第一同源群基因序列生物信息學分析及引物設計 下載中國春參考基因組（https://urgi.versailles.inra.fr／download／iwgsc／IWGSC＿RefSeq＿Assemblies／v1.0／）的1A、1B和1D基因組序列信息和基因注釋，檢索出內含子及其所在基因的位置和長度，選擇A、B和D高度同源的基因序列且序列長度小于1 000 bp的內含子用于標記開發。根據檢索到的參考基因，提取內含子上、下游各100 bp的DNA序列，合成200 bp的查詢序列。將查詢序列到NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov／）數據庫進行比對，分析不同小麥同一內含子的長度多態性。最后，利用Premier 5.0軟件對查詢序列進行批量設計引物，使上、下游引物分別落在查詢序列的前、后半段，要求引物長度在18～24 bp之間，預計退火溫度Tm值在52～60℃之間，且上游和下游引物的Tm值相差在5℃以內。引物GC含量40%～60%，且盡量避免引物二級結構Dimer、Hairpin、Falseprimer以及6個堿基配對的出現。利用小麥族多組學數據網 站 （http://202.194.139.32／blast／viroblast.php）的Blast功能，確定ILP引物的染色體位置。設計的引物由青島擎科天成生物技術有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增 根據引物合成推薦的退火溫度進行PCR擴增。30μL PCR反應體系為：25 ng／μL的模板DNA 2.0μL，5 U／μL DNA Taq聚合酶0.3μL，200μmol／L的dNTPs 2.0μL，含Mg2＋的10×PCR緩沖液3.0μL，10μmol／L的上、下游引物各2μL，用無菌雙蒸餾水補充反應體系至30μL。PCR反應擴增程序為：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。

1.2.4 PCR產物電泳及檢測 PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）電泳檢測。PAGE膠每100 mL的配置包括30%丙烯酰胺溶液（acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis，29∶1）20 mL，5×TBE緩沖液20 mL，10%過硫酸銨溶液（ammonium persulphate，AP）1 mL，四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）40μL，最后用無菌雙蒸餾水補充至100 mL。電泳完后，PAGE膠在1μg／mL的溴化乙錠溶液中染色30 min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系統下掃描照相。

2 結果與分析

2.1 引物的PCR篩選

根據中國春小麥染色體1A、1B和1D的內含子序列設計合成了41對ILP引物。以中國春-粗穗披堿草1Ht附加系和中國春為材料，對合成的這41對ILP引物進行PCR擴增篩選，結果顯示，ILP 2、ILP 8和ILP 10等18對引物可以在供試材料中擴增出1～2條多態性條帶（表2），引物ILP 5和ILP 21在供試材料中擴增不出條帶或條帶非常微弱，ILP 1、ILP 3和ILP 4等21對引物在供試材料中沒有擴增出多態性條帶。其中，引物ILP 1—ILP 22的擴增結果如圖1所示。

2.2 多態性DNA帶特異性驗證

為了驗證ILP 2、ILP 8和ILP 10等18對ILP引物擴增出多態性條帶的特異性，用這18對引物對粗穗披堿草、中國春-粗穗披堿草1Ht附加系、中國春、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、安岳排燈麥和光頭小麥進行擴增。結果發現，粗穗披堿草和中國春-粗穗披堿草1Ht附加系能擴增出對應長度的多態性條帶，而所有對照小麥均擴增不出這些條帶，因此，這些多態性條帶可能是粗穗披堿草1Ht染色體特異標記，即表明這18對引物可能可用于追蹤小麥背景中的1Ht染色體。這18對引物的序列、所在小麥染色體的物理位置、設計引物參考的基因及能擴增出多態性片段長度等信息如表2所示。

表2 在中國春-粗穗披堿草1Ht附加系中擴增出特異條帶的18對ILP引物

圖1 引物ILP 1—ILP 22在中國春-粗穗披堿草1Ht附加系和中國春中的擴增結果

2.3 多態性DNA帶染色體定位及應用

為了驗證ILP 2、ILP 8和ILP 10等18對ILP引物擴增出的特異條帶是否僅存在于粗穗披堿草1Ht染色體上，以中國春為對照，用這18對引物對中國春-粗穗披堿草1Ht附加系、1St附加系和1HtS·1BL易位系等17份小麥-粗穗披堿草染色體系（表1中序號3～19的材料）進行擴增，結果發現，含粗穗披堿草1HtS染色體的中國春-粗穗披堿草1Ht附加系、1HtS·1BL易位系和1HtS端體附加系均能擴增出上述多態性條帶，而其余14份小麥-粗穗披堿草染色體系（表1中序號6～19的材料）擴增不出這些多態性條帶，因此，這些多態性DNA帶是粗穗披堿草1HtS染色體特異分子標記。

為了驗證粗穗披堿草1HtS染色體特異分子標記對群體檢測的可用性，用這18對引物分別對中國春-粗穗披堿草1HtS·1BL易位系／CS ph1b BC1F2群體材料L1—L151進行擴增。結果發現，這18對引物均能在部分群體材料（87～103個單株不等）中擴增出目標多態性條帶，因此，這些多態性DNA帶可以作為檢測涉及粗穗披堿草1HtS的小麥-粗穗披堿草雜交種質的分子標記。其中，引物ILP 17對L1—L151中部分材料的擴增情況如圖2所示。

圖2 引物ILP 17在雜交分離群體材料中的擴增結果

3 討論與結論

3.1 物種染色體特異標記建立方法

物種特異標記的開發對輔助作物遺傳改良具有重要意義［19］。在小麥及小麥遠緣雜交研究中，使用比較廣泛的分子標記是SSR和SNP標記。其中，SSR標記已經被廣泛應用于品種一致性鑒定或基因粗定位等研究［20，21］；功能型SNP標記是由與表型變異相關基因衍生的標記，具有彌補結構多態性和功能多樣性之間差距的最大潛力，在物種遺傳多樣性［22］、基因精細定位和克隆［23］及小麥遠緣雜交種質資源鑒定等［24］方面應用潛力巨大。粗穗披堿草是小麥的優異基因源，因為沒有參考基因組，開發的分子標記比較有限［11，13，25］。內含子標記在水稻和小麥［26］、簇毛麥［27］等物種中已經被廣泛開發和運用，而在粗穗披堿草中全基因組開發和應用尚未有報道。基于此，我們開展了該項研究，建立了粗穗披堿草1HtS染色體臂特異標記18個，為小麥背景中1HtS染色質檢測提供了新方法。本研究分析小麥基因序列開發標記設置參數為內含子長度低于1 000 bp，然而實際開發出部分粗穗披堿草1HtS特異標記的長度超過1 000 bp，這表明粗穗披堿草部分基因內含子長度大于小麥，這也暗示，可能可用類似方法開發小麥族中其他小麥近緣物種染色體特異標記。

3.2 粗穗披堿草染色體特異標記開發效率

在粗穗披堿草染色體特異標記開發方面，Morris和Gill［28］建立了粗穗披堿草染色體標準C帶和N帶；Jiang等［14］開發了可用于檢測粗穗披堿草St基因組的特異探針；宮文萍等［29］建立了可追蹤小麥背景中粗穗披堿草1St、5Ht、6Ht和7Ht的寡聚核苷酸熒光原位雜交（FISH）標記。然而，由于C帶、N帶或FISH等細胞學試驗，或操作步驟繁瑣或需要特殊儀器，并不是所有實驗室都能開展。分子標記具有表現穩定、操作簡單、不受組織器官或發育時期特異性影響等優點，被科學家們廣泛應用。Gill等［13］建立了粗穗披堿草染色體特異RFLP標記，然而該標記的建立涉及放射性同位素，已不常用。宮文萍等［11］建立了粗穗披堿草1Ht染色體特異CAPS標記，標記開發效率為1.15%（1／87）。韓冉等［25］建立了粗穗披堿草1Yc染色體特異PLUG標記，標記開發效率為5.66%（3／53）。本研究通過生物信息學開發基于內含子擴增多態性的方法，建立了粗穗披堿草1HtS染色體特異標記20個，標記開發效率為43.90%（18／41），遠高于基于EST-STS開發CAPS標記［11］和開發PLUG標記［25］等方法的效率。

3.3 物種染色體特異標記的用途

Ishikawa等［26］建立了水稻單拷貝基因PLUG標記，利用小麥缺體-四體為工具，將這些標記錨定到小麥1條或多條染色體上。陳仕勇等［30］建立了10個四倍體披堿草屬物種核型。陳智華等［31］建立了野生垂穗披堿草SRAP標記。苗佳敏等［32］建立了垂穗披堿草SRAP和RAPD標記。上述研究建立的物種標記僅能鑒定小麥或小麥近緣物種染色體，但不能應用于小麥背景中近緣物種染色體鑒定。在檢測小麥背景中粗穗披堿草染色體標記方面，雖然基于EST-STS的CAPS標記［11］和PLUG標記［25］已經被建立起來，但建立的標記數量太有限，遠不能滿足對含1HtS不同片段長度的小麥-粗穗披堿草易位染色體進行鑒定。本研究建立了粗穗披堿草1HtS特異標記18個，極大地豐富和加密了1HtS染色體分子標記密度。利用這18個標記鑒定151份群體材料，發現不同標記鑒定出含粗穗披堿草1HtS染色質的單株數為87～103不等，表明這些后代材料中粗穗披堿草染色體易位斷點位置不同，因而，這些標記可以用于小麥-粗穗披堿草染色體易位系易位斷點判定。