小麥新品種濟麥70籽粒發育過程中細胞形態及內源激素的動態變化分析

李永波，崔德周，黃琛，隋新霞，樊慶琦，楚秀生，2

（1.山東省農業科學院作物研究所／農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014）

小麥是全球最重要的糧食作物之一。小麥穎果由外向內依次由外果皮、種皮、糊粉層和胚乳組成［1］。在小麥籽粒發育過程中，外層果皮和內層胚乳細胞會發生程序性細胞死亡（PCD），表現為染色質凝集、核DNA降解以及核酸酶活性增加等［2］。籽粒的這種PCD是為蛋白質和淀粉合成提供場所以及為其它細胞提供能量供應［3，4］，其進程直接影響小麥灌漿、籽粒大小和品質。因此，研究小麥籽粒PCD及相關細胞形態的動態變化對培育高產優質小麥新品種具有重要的理論指導意義。

植物PCD是內部基因有序地調控組織細胞降解的過程，對維持機體的正常生長發育及適應外界環境因子的脅迫具有重要意義［5］。種子成熟過程中，PCD的發生受干旱［6］、澇害［7］、激素等多種環境因素的影響。干旱可以促進線粒體釋放細胞色素C，進而導致PCD［6］；澇害會引起胚乳細胞染色質凝聚、核退化、線粒體破裂等PCD特點［8］；花后高溫會加速小麥胚乳細胞的降解［9］；乙烯會加速小麥種子PCD，而ABA則延遲PCD［10］。小麥籽粒發育過程中會應對干旱、干熱風等各種復雜多變的環境，環境因子決定了籽粒PCD進程，因此研究小麥籽粒PCD的動態變化過程對適應外界環境脅迫、保證后期籽粒正常灌漿意義重大。

本研究以高產穩產、抗倒、廣適小麥新品種濟麥70為材料，探究其籽粒發育過程中內部細胞形態變化與PCD進程的對應關系及內源激素ABA的動態變化，以期為進一步探究PCD調控小麥籽粒發育的分子機理奠定重要理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥新品種濟麥70由山東省農業科學院作物研究所培育，于2020年通過山東省農作物品種審定委員會審定，編號為魯審麥20200005，其主要特點是產量潛力高、高抗倒伏、抗病性好、廣適等。

1.2 番紅固綠染色

取開花后5、10、15、20、25 d具有代表性的小麥籽粒3粒進行石蠟切片。依次將切片放入二甲苯中20 min，無水乙醇中5 min，75%乙醇中5 min，然后用自來水清洗。清洗好的片子放入番紅染液中染色1～2 h，用自來水洗去多余的染料。接下來將切片依次放入50%、70%、80%梯度乙醇中各3～8 s，然后放入固綠染液中染色30～60 s，用無水乙醇進行脫水。最后，將切片置于二甲苯中透明5 min，然后用中性樹膠封片，用熒光顯微鏡（Axiocam，卡爾蔡司，Germany）進行拍照（放大100倍）。

1.3 DNA梯度檢測

取開花后5、10、15、20、25 d的小麥籽粒，用細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒（C30007，碧云天，上海）對籽粒中的DNA進行分離，具體操作詳見說明書。取1μg DNA上樣，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4 內源性激素測定

利用植物激素的酶聯免疫吸附測定法，對小麥籽粒中的內源激素進行測定，具體操作步驟詳見文獻［11］。

2 結果與分析

2.1 小麥籽粒內部細胞形態動態變化與其PCD進程動態關系

對開花后5、10、15、20、25 d的小麥品種濟麥70籽粒進行番紅-甲基綠染色和DNA梯度檢測分析，結果顯示，開花后5 d，所有籽粒細胞呈橢圓形，扇狀排布，細胞沒有出現分化現象；開花后10 d，細胞出現明顯的分化現象，最內部致密的胚乳細胞、包裹著胚乳的1～2層糊粉層細胞、單層種皮細胞以及最外面的多層果皮細胞等出現；開花后15 d，果皮細胞層數減少，胚乳細胞開始皺縮；開花后20、25 d，果皮只有單層細胞，而胚乳細胞出現破裂（圖1）。DNA梯度檢測結果顯示，只有到達開花后15 d時，DNA片段的斷裂現象才開始出現，表明在開花后15～25 d范圍內，小麥籽粒細胞正在發生PCD（圖2）。綜上所述，小麥籽粒果皮細胞層數的減少及胚乳細胞的皺縮、破裂現象是一種PCD過程。

圖1 小麥籽粒內部細胞形態結構（100×）

圖2 DNA梯度檢測

2.2 內源植物激素的動態變化

對開花后不同時間點濟麥70籽粒內源植物激素含量的分析結果（圖3）顯示，脫落酸（ABA）含量在開花后5～10 d呈現下降趨勢，10～25 d一直保持上升趨勢；生長素（IAA）含量在開花后5～10 d呈現上升趨勢，10～20 d下降，之后又上升；赤霉素（GA）含量在5～15 d呈現下降趨勢，15～20 d快速上升，20～25 d保持平穩；而玉米素核苷（ZR）卻在5～25 d持續下降?？梢钥闯?，只有脫落酸含量的變化趨勢與籽粒PCD的發生時間比較吻合，因此推測，小麥籽粒發育后期脫落酸含量的增加，可能促進了小麥籽粒PCD的發生；但是籽粒發育期間所出現的細胞形態變化，可能是由多種內源植物激素協同作用的結果。

圖3 花后5～25 d小麥籽粒內源植物激素含量變化

3 討論與結論

小麥作為重要的糧食作物，其籽粒灌漿與產量和品質息息相關。小麥籽粒早期發育過程中會出現細胞數目增加、細胞分化、PCD以及內源植物激素變化等現象，進而為后期灌漿做準備［12-14］。本研究發現，ABA在小麥籽粒早期發育過程中持續增加，而前人研究表明ABA是影響籽粒胚乳PCD的關鍵因子，可通過影響乙烯合成途徑影響胚乳PCD［15］，因此，推測籽粒早期的PCD現象可能受ABA調控。

小麥穎果在發育早期會出現果皮厚度變薄、細胞層數減少的現象。根據形態學及淀粉積累程度特點，可將籽粒果皮的發育過程分為生長期、形成期、消失期和成熟期［9，16］。本研究發現，花后15 d出現果皮層數減少、胚乳細胞破裂并伴隨PCD現象，推測此時果皮已進入消失期，通過PCD為籽粒灌漿擴容提供容納淀粉的充足內部空間。小麥籽粒早期的發育過程，會經歷細胞分裂、細胞分化、PCD現象，并伴隨著植物內源激素的不斷變化，這種種變化是為保證其籽粒灌漿能夠順利進行而準備的。小麥籽粒發育過程中的PCD發生部位是在果皮和胚乳細胞中，如小麥品種華麥8果皮細胞在花后0～15 d完成PCD過程［3］，新冬18和新冬22胚乳細胞在花后15～25 d完成PCD［6］，而小麥新品種濟麥70在花后15～20 d可檢測到PCD現象，這是典型的胚乳PCD發生時間，但卻在花后5～20 d內完成果皮的降解，這與前人研究相比有所延緩，這種PCD的差異可能與小麥品種以及氣候條件差異有關。

盡管本研究對小麥新品種濟麥70籽粒早期發育過程中細胞的形態變化、內源植物激素含量以及PCD現象做了初步解析，但對其上游調控PCD的基因是什么、ABA參與調控PCD的分子機理等問題仍需進一步研究。