體外沉默異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉移酶基因對舌鱗狀細胞癌遷移和侵襲的影響

周男 遲增鵬 李文健 趙開 王少如 王奇民 童磊 何宗軒 韓紅鈺 王瑩 陳正崗

1.濰坊醫學院口腔醫學院，濰坊261021；2.大連醫科大學口腔醫學院，大連116044；3.青島大學口腔醫學院，青島266003；4.青島大學附屬青島市市立醫院口腔醫學中心，青島266071；5.青島大學附屬醫院口腔頜面外科，青島266005；6.濟南市第四人民醫院口腔科，濟南250031

舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcino‐ma，TSCC）是最常見、最惡性的口腔癌之一，生存率低、發病率高，并且年輕患者發病率呈上升的趨勢[1]，其具有很強的快速局部轉移和侵襲的傾向[2]，患者經系統治療后預后較差[3]。目前，TSCC的治療主要采用手術、放療和化療相結合的綜合治療模式。隨著基礎研究發展，各種腫瘤生物治療方法，尤其是靶向治療技術發展較快。

Rho 蛋白是小GTPase 的Ras 超家族成員，其功能是二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）和三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）調節的開關[4-5]。活性的RhoGTPases 能與下游效應子結合，刺激控制肌動蛋白重組并調節細胞形狀、極性、動力、黏附以及信號通路等多種功能[6]。Rho蛋白的羧基端有CAAX序列（其中C代表半胱氨酸，A是脂肪族氨基酸，X 是末端任意氨基酸），Rho 蛋白的活化和定位是通過CAAX 序列的翻譯后修飾決定的。首先進行半胱氨酸殘基的異戊二烯化，然后進行AAX 序列的蛋白水解。異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉移酶（isoprenylcysteine car‐boxylmethyltransferase，ICMT） 參與翻譯后修飾的最后一步，即催化異戊烯化半胱氨酸的羧基甲基化，這種翻譯后修飾對維持信號蛋白的正常功能具有重要意義[7]。Ras超家族的GTPase 家族成員幾乎都含有CAAX 基序，其中Rho 家族與腫瘤的侵襲轉移關系密切[8-9]，而ICMT 可調節RhoGTPases（如RhoA、Rac1）的正確膜定位和活性[10]。因此，抑制CAAX蛋白翻譯后甲基化的酶ICMT是腫瘤治療的一個有希望的靶點。本研究通過探討IC‐MT 對人 TSCC CAL-27 和 SCC-4 細胞遷移及侵襲的影響及相關通路，為其的靶向治療提供一定的參考依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

人TSCC 細胞系CAL-27 購于中南大學高等研究中心，人SCC-4 細胞系由山東大學口腔醫學院饋贈，Dulbecco’s改良培養基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）高糖培養基、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），胎牛血清（BI公司，以色列），青霉素、鏈霉素（Gibco 公司，美國），TB Green Premix Ex TadTM試劑盒（TAKARA 公司，日本），實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reac‐tion，PCR）引物ICMT、RhoA、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAP‐DH）合成（上海生工生物工程有限公司），小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）片段設計、合成、脂質體轉染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）。兔抗人多克隆抗體ICMT（Proteintech 公司，美國），兔抗人多克隆抗體RhoA、基質金屬蛋 白 酶 （matrix metalloproteinase， MMP） -2、MMP-9（Abcam 公司，英國），兔抗人多克隆抗體Rho 關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶1（recombinant Rho associated coiled coil containing protein kinase 1，ROCK1）、GAPDH（CST 公司，美國），羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（CST 公司，美國），細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Tran‐swell小室（Corning公司，美國）。

1.2 細胞培養

CAL-27 和 SCC-4 細胞于 5 mL 含 10% 胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養基的培養瓶（25 cm2）中培養，放置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中。瓶底細胞長至約90%后，棄原培養基，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，加入1 mL 胰蛋白酶置于37 ℃環境下消化3~5 min，顯微鏡下觀察到細胞間隙增大，胞質回縮后立即加入等量的含血清培養基終止消化，按順序吹打瓶底細胞，避免出現氣泡，將細胞懸液吸取至 15 mL 離心管中 1 000 r·min-1離心 5 min，棄上清，向離心管中加入10 mL 培養基，反復吹打為單細胞懸液，按1∶2的比例傳代至新培養瓶中。

1.3 siRNA轉染

構建3 條針對ICMT 基因序列的特異性ICMT-siRNA（表1）和1 條陰性序列作為對照。轉染分組分為實驗組（細胞轉染ICMT-siRNA），空白組（細胞僅加轉染試劑，不轉染siRNA），陰性對照組（細胞轉染無關siRNA 序列）。轉染前1 d 將對數生長期的 CAL-27 和 SCC-4 細胞以每孔 5×105個的密度接種于6 孔板，細胞密度長至30%~50%進行轉染。嚴格按照轉染說明書進行操作。轉染48 h后，檢測基因的表達。

表 1 針對ICMT基因序列設計3條ICMT-siRNATab 1 Three ICMT-siRNA sequences designed for IC‐MT gene

1.4 qRT-PCR檢測各組ICMT、RhoA的mRNA表達

每組細胞轉染48 h 后，分別提取各組細胞的總RNA，并使用紫外光分光光度計以測定RNA 的含量。反轉錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），以此cDNA為模板行PCR擴增反應。GAPDH為內參照。ICMT引物序列：上游5’-CGGCATCCTTCTTACGTCGG-3’，下游5’-CCACACTGTCAGGGCATAGC-3’；RhoA 引物序列：上游 5’-TGTGGCAGATATCGAGGTGGATGG-3’，下游5’-GGCCTCAGGCGATCATAATCTTCC-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGA‐AC-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR 反應條件：95 ℃ 30 s，然后 95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，共40 個循環。由ABIPRISM 7000 熒光定量PCR 儀完成自動熒光信號實時監測及數據分析。利用 2-ΔΔCt公式計算 mRNA 相對表達量，其中 ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因、ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，Ct 值即循環閾值。根據ICMT 的mRNA 的表達明確沉默效率以進行后續實驗。

1.5 蛋白質免疫印跡法檢測蛋白的表達

提取轉染48 h 后的各組細胞的總蛋白以及膜蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白質的濃度。100 ℃下變性5 min，每泳道等量上樣50 μg 蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳后用濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉PVDF 膜1 h 后，加入一抗（ICMT，1∶1 000；RhoA，1∶5 000；ROCK1，1∶1 000；MMP-2，1∶1 000；MMP-9，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000），4 ℃過夜。用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水 （triethanolamine buffered saline，TBST） 洗膜后與IgG 二抗（1∶50 000）室溫孵育2 h，再用TBST 洗膜3 次，電化學發光法顯色、曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 Transwell侵襲實驗

將已鋪好基質膠的Transwell 小室置于24 孔板，上室與下室分別加入500 μL 無血清培養基，37 ℃培養箱水化2 h。已轉染的細胞消化、離心后，PBS 沖洗，加入無血清培養基重懸成單細胞懸液，計數使密度調整為每毫升3×105個，上室加入 500 μL 細胞懸液，下室加入 750 μL 含血清培養基，置培養箱48 h 取出，PBS 沖洗，干棉簽輕擦去上室未遷細胞，PBS沖洗。甲醛室溫固定30 min，吸干固定液，0.1%結晶紫染色30 min。PBS 沖洗，置顯微鏡下觀察拍照，隨機選取5個不同視野計數穿膜細胞數，取均值，實驗重復3次。

1.7 細胞劃痕實驗

將已轉染的細胞接種于6孔板，培養至細胞密度達90%時，用200 μL 槍頭在中央沿直尺垂直劃痕。PBS沖洗3次，加無血清培養基于培養箱內培養，于顯微鏡下分別觀察0、24、48 h 的劃痕愈合情況并拍照，計算24 h 及48 h 的相對愈合面積，即0 h 劃痕面積分別減去24、48 h 的劃痕面積，其差值分別除以0 h劃痕面積。實驗重復3次。

1.8 統計學分析

用SPSS 22.0 軟件分析各組結果，計量資料兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICMT、RhoA的mRNA表達水平

實時熒光定量PCR 結果顯示，轉染ICMT-siR‐NA 后實驗組ICMT 的mRNA 表達水平明顯下降（P<0.05）。各實驗組mRNA 表達量相比，ICMT-siRNA-1 和ICMT-siRNA-3 兩組沉默效率較高，作為實驗組進行下一步研究。RhoA 的mRNA 表達各組的差異無統計學意義（P>0.05）（圖1）。

2.2 蛋白的表達水平變化

蛋白質免疫印跡實驗結果顯示，實驗組ICMT蛋白表達水平明顯下降（P<0.05），RhoA 蛋白各組表達水平無明顯改變（P>0.05）；實驗組RhoA膜蛋白表達水平明顯下降（P<0.05），ROCK1蛋白表達下降（P<0.05），MMP-2、MMP-9 的表達降低（P<0.05）（圖2、3）。

2.3 ICMT-siRNA對細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗顯示（圖4），24、48 h 的實驗組相對愈合面積均明顯小于空白、陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05），表明細胞的遷移能力降低。

2.4 ICMT-siRNA對細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗示（圖5），轉染48 h后實驗組侵襲細胞數明顯低于空白、陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05），表明細胞侵襲能力降低。

圖 1 轉染ICMT-siRNA后ICMT、RhoA mRNA的表達Fig 1 Expression of ICMT and RhoA mRNA after ICMT-siRNA transfection

圖 2 CAL-27細胞轉染ICMT-siRNA后蛋白的表達Fig 2 The Expression of protein after ICMT-siRNA transfection of CAL-27 cells

圖 3 SCC-4細胞轉染ICMT-siRNA后蛋白的表達Fig 3 The Expression of protein after ICMT-siRNA transfection of SCC-4cells

圖 4 劃痕實驗結果 倒置相差顯微鏡 ×40Fig 4 The results of scratch test inverted phase contrst microscope × 40

圖 5 Transwell侵襲實驗結果 倒置相差顯微鏡 ×100Fig 5 The results of Transwell invasion assay inverted phase contrast microscope ×100

3 討論

口腔癌是全球的第六大惡性腫瘤，近90%的口腔癌為口腔鱗狀細胞癌。TSCC 約占原發性口腔鱗狀細胞癌的30%，隨著年齡的增長和臨床分期的增加，生存率逐漸下降[11]。局部浸潤和遠處轉移是死亡的主要原因，因此探討促進其浸潤和轉移的分子機制很有必要。

蛋白質的翻譯后修飾在細胞生物學的許多方面起著至關重要的作用。ICMT 作為一種翻譯后修飾的酶，主要修飾CAAX 蛋白，包括小GTPase，如Ras和Rho蛋白[12]。ICMT 的甲基化對Ras和Rho蛋白在細胞中的正確膜定位和活化至關重要。Rho蛋白能夠通過影響肌動球蛋白聚合和收縮、細胞黏附等來調控細胞的形態和運動[13]。有研究[14]表明，當ICMT 活性降低時，影響Rho 蛋白甲基化，RhoGDI 與Rho 蛋白的結合親和力增強從而削弱了RhoGTP 結合和激活Rho 蛋白的能力，從而抑制Rho 蛋白信號轉導和Rho 蛋白介導的生物學行為，該研究明確了ICMT催化的甲基化在腫瘤細胞轉移中的作用。

RhoA 是Rho 家族的一個成員，在乳腺癌、胃癌、頭頸鱗狀細胞癌、膀胱癌、結直腸癌和宮頸癌中高表達[15-20]。對鼻咽癌的研究[21]表明，抑制ICMT 可抑制鼻咽癌細胞的RhoA 活性，從而抑制RhoA 介導的下游信號轉導。并且有研究[22]發現，抑制ICMT 甲基化減少了高轉移MDA-MB-231 乳腺癌細胞系的侵襲和遷移，其影響歸因于RhoA 功能受損，從而進一步闡明了甲基化在RhoGTPases功能中的作用。此外還有研究[23-24]證實，ICMT 在肺癌、胰腺癌中發揮重要作用，但其對口腔鱗狀細胞癌的影響尚未見相關報道。

本實驗將ICMT-siRNA 轉染至TSCC CAL-27和SCC-4 細胞中沉默ICMT 基因，從而降低了IC‐MT 蛋白的表達，RhoA 蛋白表達無明顯改變，但RhoA 膜蛋白的表達降低，細胞的遷移和侵襲能力降低，推測ICMT 可能通過影響RhoA 的甲基化和膜定位以降低RhoA 活性來影響TSCC 細胞的遷移和侵襲，但并不影響RhoA 的表達，推測ICMT 基因與舌癌的遷移和侵襲有關。本實驗還發現ICMT表達降低后RhoA 下游蛋白ROCK1 表達降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達量降低。

Rho 關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶（ROCK1和ROCK2），也是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是結合活性RhoA 的最佳效應蛋白。ROCK 的激活可能導致不同的細胞事件，特別是細胞骨架的變化，影響細胞-細胞或細胞-基質黏附和細胞遷移[25]。有研究[26]報道，RhoA 定位在細胞膜上，在那里它可以被激活，并通過向ROCK 和肌動球蛋白發出信號來促進侵襲和轉移。RhoA 還可通過ROCK 信號通路參與血管內皮生成因子誘導的腫瘤血管生成，并能促進腫瘤細胞透過脈管內皮從而發生遠處轉移[27]。本實驗通過沉默ICMT 基因，抑制了RhoA的甲基化使RhoA 未能正確定位于細胞膜而活性降低，ROCK1 表達量降低，推測ICMT 影響TSCC遷移及侵襲可能與RhoA-ROCK信號通路有關。

腫瘤細胞的遷移侵襲需要改變細胞和細胞基質的黏附和重塑細胞外基質。MMP 一個龐大的蛋白酶家族，它能降解基底膜和細胞外基質，在腫瘤的發生、生存、侵襲和轉移中起著重要作用，尤其是MMP-2 和MMP-9，在多種腫瘤中發揮作用[28]，能降解Ⅳ型膠原，有淋巴結轉移和加速新的毛細血管生成的作用。在TSCC中，由于其腫瘤侵襲和轉移率高，死亡率也較高，MMP-2和MMP-9的表達與TSCC 的早期診斷、局部復發、轉移和生存率有關，因此可作為患者預后不良的風險潛力的指標[29]。本實驗中，抑制ICMT 表達后，MMP-2 和MMP-9 表達降低，遷移侵襲能力下降，推測ICMT 通過參與對RhoA 等蛋白的翻譯后修飾，降低了蛋白活性，間接影響舌癌的遷移及侵襲。

綜上所述，ICMT-siRNA 可以抑制ICMT 的表達，從而抑制RhoA 的甲基化，使細胞膜上RhoA的表達降低，降低了其活性，而不改變胞內RhoA蛋白的總量。RhoA 下游ROCK1 表達降低，推測這可能與RhoA-ROCK 通路受到抑制有關。MMP-2和MMP-9的表達降低，也證實了TSCC細胞的遷移侵襲能力的下降。因此，ICMT 在TSCC 細胞遷移、侵襲中可能發揮了重要作用，有望成為治療TSCC 的有效靶點，但其具體機制仍待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。