弓形蟲病診斷技術在基層獸醫實驗室的應用

歐陽志良 黃添祥 溫 蕾

廣東省東莞市厚街鎮農業技術服務中心 廣東 東莞 523960

弓形蟲是一種細胞內寄生蟲,主要生活在細胞內,并能隨著血液流動向全身各處,所以可能威脅到全身各個器官系統。其生長階段要求兩個宿主,中間宿主有魚、鳥、昆蟲等,十分廣泛,終宿主則是貓科動物。因為這一點,其可以在世界范圍內流行,引發人獸共患病。如果感染的是孕婦,基本有一半的幾率可以垂直感染給胎兒,其余可能出現流產、死胎、畸形等。如果是感染的寵物,可能導致懷孕寵物流產、死亡。在畜牧方面,本病也會帶來繁殖困難、大量死亡等情況。近年來,伴隨著寵物飼養的流行,人類通過接觸寵物感染弓形蟲病的比例日益增加。因此,各相關實驗室積極選擇快速有效的方法對本病進行檢測,并隨著感染頻率的增加,要求推廣更加靈敏高效的檢測手段。目前對本病的診斷方法有如下幾種：

1 染色試驗(DT)

該方法曾專門用于本病病原檢測,特異性、靈敏度和可重復性都比較強。但缺陷在于該方法必須使用活的、可感染的速殖子進行檢測,而這帶來極大的危險,所以只能在生物安全水平高的實驗室應用。目前,這一技術得到改良,將弓形蟲蟲體用甲醛固定在玻片上作為抗原,孵育待測血清,之后使用特殊的添加物,可以在蟲體周圍展示出淡黃色,列為陽性。這樣一來操作簡單,快速,而且特異性強,所以適用于進行現場篩查。

2 凝集試驗

該方法有直接凝集(DAT)、間接凝集(IHA)和間接熒光抗體試驗(IFAT)三種。就該方法而言,操作簡單、結果出的快,敏感性、特異性和重復性也都良好。以三種不同方式對比來講,陽性反應出現時間DAT比IHA快,所以更容易檢測出早期感染的IgG抗體。而IFAT在靈敏度和特異性方面更具優勢,但也有更高的成本,同時不適合存在類風濕因子干擾的個體檢測。

3 免疫膠體金技術

該技術利用抗原抗體相結合的原理,用膠體金探針標記相應的抗原或抗體,進而放大信號,然后借助光鏡、目測、顯影等方法給出診斷結果。大體分為免疫金銀染色法、快速斑點免疫金滲濾法和膠體金免疫層析法(GICA)。其中GICA是近年來應用普遍且發展迅速的新技術之一,將蛋白抗體、新型材料、層析技術和膠體金等相結合,表現出成本低,操作簡單,試劑盒種類繁多,檢測對象范圍廣等優勢,所以多用于動物實驗室開展現場篩查。

4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA也是當前應用很廣泛的技術,操作相對簡便,結果準確,僅次于PCR技術。對于本病的檢測,有常規和間接ELISA法、葡萄球菌A蛋白ELISA(SPA-ELISA)、更高特異性的DOT(斑點)-ELISA、親和素-生物素-ELISA和PCR-ELISA。其中PCR-ELISA的敏感性、特異性都較強,也比較穩定。其PCR產物經過標記后與特異性探針雜交,再通過相關酶顯色反應,可通過酶標儀檢測OD值,判斷感染情況。該方法的檢測閾值是20fg左右的弓形蟲DNA,靈敏度很高,不易發生交叉反應,重復性好[1]。隨著分子生物學發展、熒光PCR技術的應用推廣,對于本病的診斷在基層動物實驗室有了更好的選擇。

5 熒光定量PCR技術

常規的PCR技術,操作中容易造成污染、而且對弓形蟲感染者不同時期感染程度的量值變化情況無法掌握。該方法增加了熒光探針雜交,實現了DNA實時定量；在封閉狀態下進行檢測,它的特異性和準確性都優于其它技術,不容易交叉污染,因此成為了當今實驗室弓形蟲診斷和研究非常重要的手段之一。2019年,李雙星等[2]基于新一代Taqman-MGB探針技術,從該方法進行延伸,給出可以實時檢測的技術形式,特異性和敏感性更強,為本病的臨床病原檢測等方面提供技術支撐,為未來犬弓形蟲亞單位疫苗的效果評價也提供了理論基礎。由于分子生物學檢測方法對實驗室要求高,且診斷試劑價格較貴,不適用于在基層獸醫實驗室和動物醫院實驗室推廣。

展望

近幾年通過大量的試驗研究,在弓形蟲病診斷方面取得很大的進展,這有助于本病防控工作的開展,良好控制了本病的擴散。但對本病的診斷仍然存在以下問題：現場快速檢測的商品化試劑盒不多；單一診斷不準或成本高；診斷的抗原或抗體純度不夠高、制備難、成本高；大多數精確的診斷技術對實驗室要求高,用于實驗室研究更合適,基層應用仍然不廣。基于對解決這些問題的考慮,在醫學技術和檢測技術逐步發展的背景下,積極建立綜合檢測系統,用以彌補單一診斷方法的不足、更多的用于基層獸醫實驗室和動物醫院實驗室的推廣,是接下來值得探討的問題。對此需要相關工作人員加強對本病免疫學診斷方法的研究和總結,立足于當前方法的缺陷和限制,進行改進和優化,提出更有效的檢測技術。