天葵子UPLC指紋圖譜建立及指標(biāo)性成分測(cè)定△

劉曉霞，丁青，陳芳，梁月儀，王利偉，李樂(lè)，孫冬梅

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

天葵子為毛茛科植物天葵Semiaquilegiaadoxoides(DC.)Makino的干燥塊根，夏初采挖，洗凈、干燥，除去須根[1]。天葵子味甘、苦，性寒，歸肝、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利水通淋之功效，用于治療癰腫療瘡、乳癰、痕病、毒蛇咬傷等證[2]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，天葵子中化學(xué)成分主要為內(nèi)酯類(lèi)[3]、生物堿類(lèi)[4]、氰基與硝基類(lèi)[5]。其中，內(nèi)酯類(lèi)的代表性成分主要有格列風(fēng)內(nèi)酯、耬斗菜內(nèi)酯、蝙蝠葛內(nèi)酯等，生物堿類(lèi)的代表性成分主要有木蘭花堿、唐松草酚定、天葵堿A等，氰基與硝基類(lèi)代表性成分主要有紫草氰苷等手性化合物。在《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版中收載的天葵子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中包括來(lái)源、性狀、鑒別、檢查(水分、總灰分、酸不溶性灰分)、浸出物等項(xiàng)目，但是缺乏相關(guān)指標(biāo)性成分含量測(cè)定與指紋圖譜研究，難以全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)對(duì)10批天葵子藥材進(jìn)行研究，初步建立了天葵子指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上同時(shí)測(cè)定格列風(fēng)內(nèi)酯和木蘭花堿的含量，以期為天葵子藥材質(zhì)量的整體評(píng)價(jià)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

共收集10批天葵子藥材，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定均為毛茛科植物天葵Semiaquilegiaadoxoides(DC.)Makino的干燥塊根。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 天葵子藥材樣品信息

對(duì)照品格列風(fēng)內(nèi)酯(批號(hào)：18091205，純度：98.29%，成都普菲德生物股份有限公司)；對(duì)照品紫草氰苷(批號(hào)：63492-69-3，純度：99.6%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)；對(duì)照品木蘭花堿(批號(hào)：wkq17063003，純度：98%，四川省維克奇生物科技有限公司)；磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、乙腈和甲醇(默克股份有限公司)均為HPLC級(jí)；水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；甲醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.2 儀器

Vanquish型超高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；1290型超高效液相色譜儀(安捷倫公司)；ACQUITY HSS T3型色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司)；ME204E型萬(wàn)分之一天平、XP26型百萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY HSS T3型色譜柱，以甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～12 min，100%～94%B；12～47 min，94%～40%B)；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為15 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取對(duì)照品格列風(fēng)內(nèi)酯、紫草氰苷、木蘭花堿適量，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇分別制成含格列風(fēng)內(nèi)酯0.04 mg·mL-1、紫草氰苷0.04 mg·mL-1、木蘭花堿0.04 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜

2.4.1精密度試驗(yàn) 取天葵子藥材供試品溶液(批號(hào)：TKZ04)，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積1 μL，以紫草氰苷峰為參照峰S，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于3%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn) 取天葵子藥材供試品(批號(hào)：TKZ04)溶液，按2.3項(xiàng)下供試品制備溶液方法制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以紫草氰苷峰為參照峰S，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于3%，結(jié)果表明，分析方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取天葵子藥材供試品(批號(hào)：TKZ04)溶液，于室溫下放置，分別在制備后0、2、9、16、22、24 h后按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以紫草氰苷峰為參照峰S，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，結(jié)果表明，24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性較好。

2.4.4指紋圖譜的建立 精密稱取不同批次天葵子藥材約1.0 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)進(jìn)行共有峰匹配(圖1)，生成對(duì)照指紋圖譜(圖2)。結(jié)果顯示，天葵子藥材指紋圖譜具有17個(gè)共有峰，采用UPLC-二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，根據(jù)對(duì)照品指認(rèn)了3個(gè)特征峰，其中5號(hào)峰為格列風(fēng)內(nèi)酯、7號(hào)峰為紫草氰苷、14號(hào)峰為木蘭花堿。計(jì)算不同批次天葵子藥材樣品指紋圖譜相似度，其相似度均大于0.9，見(jiàn)表2，說(shuō)明不同批次間的一致性與重復(fù)性較好。

圖1 天葵子樣品UPLC指紋圖譜疊加圖

注：5.格列風(fēng)內(nèi)酯；7.紫草氰苷；14.木蘭花堿。圖2 天葵子樣品UPLC對(duì)照指紋圖譜

表2 天葵子樣品UPLC指紋圖譜相似度結(jié)果

2.5 含量測(cè)定

2.5.1專(zhuān)屬性考察 精密吸取天葵子藥材供試品(批號(hào)：TKZ04)溶液、對(duì)照品溶液與空白溶劑，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，空白溶劑色譜中在與格列風(fēng)內(nèi)酯、木蘭花堿相應(yīng)的保留時(shí)間位置上沒(méi)有色譜峰，表明提取溶劑對(duì)格列風(fēng)內(nèi)酯、木蘭花堿的含量測(cè)定無(wú)干擾，表明專(zhuān)屬性良好。

注：1.格列風(fēng)內(nèi)酯；2.木蘭花堿。圖3 天葵子樣品、對(duì)照品和空白溶劑UPLC圖

2.5.2線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品格列風(fēng)內(nèi)酯5.339 mg、木蘭花堿5.246 mg，置10 mL量瓶中，加70%甲醇制成含格列風(fēng)內(nèi)酯524.770 μg·mL-1、木蘭花堿514.108 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、1.0、3.0 mL分別置于100、100、10、5、5 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，分別制成格列風(fēng)內(nèi)酯和木蘭花堿系列混合對(duì)照品溶液，連同混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。格列風(fēng)內(nèi)酯回歸方程為Y=0.418 6X-0.239 2，r=1.000 0，格列風(fēng)內(nèi)酯質(zhì)量濃度在0.525～524.770 μg·ml-1與峰面積線性關(guān)系良好；木蘭花堿回歸方程為Y=0.099 4X-0.055 3，r=0.999 7，木蘭花堿質(zhì)量濃度在0.514～514.110 μg·ml-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.3精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果顯示，格列風(fēng)內(nèi)酯峰面積RSD為0.41%，木蘭花堿峰面積RSD為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次天葵子藥材樣品(批號(hào)：TKZ04)，按2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，格列風(fēng)內(nèi)酯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22 mg·g-1，RSD為2.24%；木蘭花堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.61 mg·g-1，RSD為2.77%，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.5.5加樣回收率試驗(yàn) 采用對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定，按對(duì)照品格列風(fēng)內(nèi)酯、木蘭花堿加入量與供試品溶液中待測(cè)成分格列風(fēng)內(nèi)酯、木蘭花堿含量為0.5∶1、1∶1、1.5∶1設(shè)計(jì)3組試驗(yàn)，每組平行3份，分別精密移取適量的格列風(fēng)內(nèi)酯對(duì)照品儲(chǔ)備液、木蘭花堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，在氮吹儀下吹干。取已知含量的天葵子藥材(批號(hào)：TKZ04)粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置3組錐形瓶中，每組平行3份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算回收率和RSD，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，天葵子藥材中格列風(fēng)內(nèi)酯含量測(cè)定分析方法回收率為92.27%～98.36%，RSD為2.13%，木蘭花堿含量測(cè)定分析方法加樣回收率為89.69%～95.81%，RSD為2.31%，符合《中國(guó)藥典》2020年版9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求。

表3 天葵子藥材中格列風(fēng)內(nèi)酯和木蘭花堿含量測(cè)定加樣回收率試驗(yàn)

2.5.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取天葵子藥材供試品(批號(hào)：TKZ04)溶液，于室溫下放置，分別在制備后0、2、9、16、22、24 h后按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，在24 h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定格列風(fēng)內(nèi)酯含量RSD為1.32%；木蘭花堿含量RSD為0.97%，表明24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性較好。

2.5.7樣品測(cè)定 對(duì)10批天葵子藥材按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，格列風(fēng)內(nèi)酯、木蘭花堿含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 10批天葵子藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2) mg·g-1

3 討論與結(jié)論

已有研究采用HPLC測(cè)定天葵子中格列風(fēng)內(nèi)酯、東方唐松草苷的含量[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，天葵子中氰基類(lèi)化合物手性異構(gòu)體之間在受熱條件下存在轉(zhuǎn)化，故暫不作為含量測(cè)定指標(biāo)。鑒于其化學(xué)成分尚缺乏有效性研究報(bào)道，選擇穩(wěn)定性較好且含量相對(duì)較高的格列風(fēng)內(nèi)酯、木蘭花堿作為測(cè)定指標(biāo)。10批天葵子藥材格列風(fēng)內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15～0.39 mg·g-1，木蘭花堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.59～2.22 mg·g-1。

本研究采用UPLC建立天葵子指紋圖譜及含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示，該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好；色譜分離時(shí)，降低柱溫能使氰基類(lèi)化合物手性異構(gòu)體有效分離；在流動(dòng)相中加入適量的磷酸，能使相似組分有較好的峰形和分離度。分別考察了不同水相(0.1%磷酸、0.05%磷酸和0.1%甲酸)、2種不同類(lèi)型色譜柱[Waters ACQUITY HSS T3(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY CORTECS T3(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)]，還比較了不同檢測(cè)波長(zhǎng)(221、260、300 nm)、不同柱溫(13、15、18 ℃)、不同流速(0.20、0.25、0.30 mL·min-1)對(duì)天葵子指紋圖譜色譜峰的影響。結(jié)果顯示，采用Waters ACQUITY HSS T3型(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)色譜柱，以0.05%磷酸為水相，在檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm、柱溫15 ℃、流速0.25 mL·min-1色譜條件下色譜峰的分離度較好、基線平穩(wěn)、色譜峰數(shù)目較多，且信號(hào)響應(yīng)較高。

通過(guò)單因素分析，考察了提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇)、提取方式(超聲提取、回流提取)、提取時(shí)間(15、30、45 min)對(duì)天葵子藥材指紋圖譜及含量測(cè)定的影響，根據(jù)結(jié)果最終確定最佳供試品制備方法為用70%甲醇加熱回流30 min。

本研究通過(guò)考察10批不同產(chǎn)地的天葵子藥材指紋圖譜，確定了17個(gè)共有峰，指認(rèn)了3個(gè)，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間一致性較好，但相對(duì)峰面積差異較大。不同產(chǎn)地天葵子藥材的指紋圖譜的整體圖貌基本一致，指紋圖譜的相似度較高，均大于0.9，說(shuō)明不同產(chǎn)地天葵子藥材的化學(xué)組成一致性較好，但含量存在一定差異。本研究在《中國(guó)藥典》2020年版天葵子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，增加了天葵子指紋圖譜方法和以格列風(fēng)內(nèi)酯、木蘭花堿為測(cè)定指標(biāo)的含量測(cè)定方法，方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，提升了天葵子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可為提高天葵子藥材的質(zhì)量及保證臨床用藥有效性提供參考。