Box-Behnken響應面法優(yōu)化滇黃精產地加工炮制一體化工藝對黃精多糖的影響△

金鵬程，吳麗華，吳昕怡，李智敏，田浩，肖丹*

1.云南省農業(yè)科學院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，云南 昆明 650221；3.云南省農業(yè)科學院 熱區(qū)生態(tài)農業(yè)研究所，云南 楚雄 651300

中藥材產地加工是指在藥材基原植物的最佳采收年限、采收期內對其進行采收，在采收地進行去除非藥用部位、清洗、分級挑選、切制、浸漂、蒸制、煮制、發(fā)汗、干燥、分割部位、包裝等1個或多個加工炮制步驟[1-3]，是中藥產業(yè)鏈中原料與飲片的中間環(huán)節(jié)[4]，也是保證和提高藥材質量的重要環(huán)節(jié)[5-6]。滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.為百合科黃精屬植物，味甘，性平，歸脾、肺、腎經，主要用于脾胃氣虛、內熱消渴、肺虛燥咳等[7]，臨床多用于改善心肺功能，治療糖尿病、脂肪肝，延緩衰老[8-10]。黃精多糖為滇黃精的主要有效成分，也是《中華人民共和國藥典》2020年版中滇黃精的質量評價指標[7]。

目前，滇黃精產地加工大多采用自然曬干，自然環(huán)境與晾曬條件等因素對藥材品質影響較大。不同加工炮制方法得到的滇黃精質量參差不齊，存在加工過程耗時長、藥材易霉變、黃精多糖含量降低等問題[11-13]。為提高滇黃精藥材質量、減少黃精多糖的損失，需要對其產地加工炮制一體化工藝開展研究。目前，滇黃精產地加工多運用傳統(tǒng)單因素試驗和正交試驗法[14-18]。響應面優(yōu)化法相對于傳統(tǒng)方法，可全面系統(tǒng)考察因素與因素之間、因素與響應面之間的交互作用[17]。現有關Box-Behnken響應面法優(yōu)化滇黃精產地加工炮制一體化工藝對黃精多糖的影響文獻鮮有報道。因此，本研究采用單因素試驗與響應面優(yōu)化相結合的方法，以黃精多糖作為評價指標，優(yōu)化滇黃精產地加工炮制一體化工藝，為滇黃精藥材產地加工炮制一體化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-5500型紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；150B型中藥材粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司)；FA1004型萬分之一電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

1.2 試藥

D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201707，純度：99.9%，中國食品藥品檢定研究院)；無水乙醇、蒽酮、濃硫酸均為分析醇；水為純化水。

滇黃精均由玉溪市祥馨農業(yè)技術開發(fā)有限公司種植，經云南省農業(yè)科學院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為百合科黃精屬植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.。

2 方法與結果

2.1 預處理

取基地種植的3 年生滇黃精植株，去除地上部分，取根莖部，去除泥沙、須根，洗凈備用。

2.2 黃精多糖測定

2.2.1對照品溶液制備 精密稱取對照品D-無水葡萄糖33.0 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.2標準曲線制備 精密量取D-無水葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置20 mL刻度試管中，加水至2.0 mL，搖勻，置冰水浴中，緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度，混勻，沸水浴10 min，取出，立即冰水浴10 min。按紫外-可見分光光度法，以純化水為空白對照，在582 nm處測定吸光度(A)。

2.2.3線性關系考察 按照2.2.2項下方法，測定A。以A為縱坐標(Y)，黃精多糖質量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得線性回歸方程Y=0.004 4X+0.063 5(r=0.997 6)，表明D-無水葡萄糖在0.033～0.198 mg·mL-1線性關系良好。

2.2.4供試品溶液制備 精密稱取60 ℃干燥至恒重的供試品粉末0.250 0 g，置圓底燒瓶中，加入80%乙醇150 mL，浸泡30 min，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，濾渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘渣和濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，濾渣和燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，合并濾液，冷卻，移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2 mL，搖勻，冰水浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度，混勻，沸水浴10 min，取出，立即冰水浴10 min。按紫外-可見分光光度法，在582 mm波長處測定A。

2.2.5精密度試驗 精密量取D-葡萄糖對照品溶液0.5 mL，以純化水為空白對照，在582 nm波長處測定A，RSD為0.46%，表明方法精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，以純化水為空白對照，分別在0、2、4、6、8 h測定A，RSD為0.77%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復性試驗 精密稱取滇黃精供試品粉末6份，每份0.25 g，按2.2.4項下方法制備供試品溶液，以純化水為空白對照，在582 nm波長處測定A，RSD為0.55%，表明方法重復性良好。

2.2.8加樣回收率試驗 取已知黃精多糖含量的滇黃精樣品6份，每份0.25 g，按2.2.4項下方法制備，分別于具塞試管中加入對照品溶液1 mL，在582 nm波長處測定A，計算加樣回收率，平均加樣回收率為97.54%，RSD為0.90%，表明該方法準確度良好。

2.3 單因素試驗

2.3.1蒸制時間 取按2.1項下方法凈制的滇黃精鮮品，分別蒸制5、10、15、20、25、30 min，切3 mm厚片，60 ℃干燥至水分<15%，考察不同蒸制時間對滇黃精中黃精多糖含量的影響。如圖1所示，蒸制時間為5～20 min時，黃精多糖含量隨蒸制時間增加，20 min時達到最大值，此時，黃精多糖質量分數為11.55%；蒸制20～30 min，黃精多糖含量隨蒸制時間增加而下降。因此，選擇20 min為最佳蒸制時間；10、30 min為后續(xù)優(yōu)化實驗的最低、最高水平。

圖1 不同蒸制時間下黃精多糖質量分數

2.3.2切片厚度 取按2.1項下方法凈制的滇黃精鮮品，蒸制20 min后，分別切片1、2、3、4、5 mm，60 ℃干燥至水分<15%，考察滇黃精切片厚度對黃精多糖含量的影響。如圖2所示，切片厚度為1～3 mm時，黃精多糖含量隨片厚增加而增大；切片厚度達3 mm時黃精多糖含量達到最大值；切片厚度為3～5 mm時，黃精多糖含量隨片厚增加呈下降趨勢。因此，選擇3 mm為滇黃精最佳切片厚度；1、5 mm為后續(xù)優(yōu)化試驗的最低、最高水平。

圖2 不同切片厚度下黃精多糖質量分數

2.3.3干燥溫度 取按2.1項下方法凈制后滇黃精鮮品，蒸制20 min、切制成3 mm厚片，分別按30、40、50、60、70、80、90、100 ℃干燥至水分<15%，確定不同干燥溫度對黃精多糖的影響。如圖3所示，干燥溫度為40～60 ℃時，黃精多糖含量隨干燥溫度的增加而增加；60 ℃時黃精多糖含量達到最大值；60～100 ℃時，黃精多糖含量隨干燥溫度增加呈下降趨勢。因此，選擇60 ℃為滇黃精最佳干燥溫度，40、80 ℃為后續(xù)優(yōu)化試驗的最低、最高水平。

圖3 不同干燥溫度下黃精多糖質量分數

2.4 響應面法優(yōu)化試驗

2.4.1試驗設計及結果 根據單因素試驗結果和Box-Behnken響應面試驗設計原理，選取3個因素為自變量，分別為蒸制時間(A)、切片厚度(B)、干燥溫度(C)，每個因素取3個水平，以黃精多糖含量為響應值，設計中心組合試驗。各因素及水平設計見表1。采用Design-Expert 8.0.5b軟件設計Box-Behnken響應面試驗設計方案，方案與結果見表2。共考察17組工藝參數，其中13～17組為中心設計(零點試驗)。

表1 滇黃精加工炮制工藝Box-Behnken試驗設計因素與水平

表2 滇黃精加工炮制工藝Box-Behnken的試驗設計方案與結果

2.4.2方差分析及數據處理 回歸模型方差分析及回歸系數顯著性檢驗結果見表3，擬合得到回歸方程為Y=0.138+0.012A+0.059B+0.023C+0.60×10-4AB-0.238×10-4AC+0.306×10-4BC-0.246×10-3A2-0.855×10-2B2-0.186×10-3C2，P<0.01，r為0.990 5，表明該模型對本實驗的擬合度較好，在本實驗研究范圍內差異有統(tǒng)計學意義。

表3 滇黃精加工炮制工藝回歸模型方差分析結果

因素B、B2、C2對響應值的影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，因素A、C、A2對響應值的影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，因此，滇黃精產地加工各因素對黃精多糖的影響不是簡單的線性關系，A、B、C 3個因素之間存在顯著交互作用。本模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項P=0.818>0.05，差異無統(tǒng)計學意義，說明該回歸模型與實驗數據擬合程度良好、試驗誤差小，可以采用其優(yōu)化滇黃精產地加工炮制一體化工藝。

運用Design-Expert 8.0.5b軟件進行數據擬合，3D圖直觀體現A、B、C 3個因素之間兩兩交互作用對黃精多糖含量的影響，結果見圖4～6。滇黃精A、B交互作用響應面3D圖坡度平緩，表明這2個因素交互作用較弱，對黃精多糖含量影響較小。滇黃精C與A、C與B交互作用響應面3D圖坡度較陡，表明C與A、C與B交互作用較強，對黃精多糖含量影響顯著。根據Design-Expert 8.0.5b軟件分析計算，滇黃精產地加工炮制一體化優(yōu)化工藝為A：22.24 min、B：3.66 mm、C：61.19 ℃，預測黃精多糖質量分數為12.29%。

圖4 多糖提取率隨蒸制時間和切片厚度變化的響應面

圖5 多糖提取率隨干燥溫度和蒸制時間變化的響應面

圖6 多糖提取率隨干燥溫度和切片厚度的變化的響應面

2.5 驗證實驗

根據2.4.2項下優(yōu)化工藝及實際操作條件調整為滇黃精凈制樣品A:22 min、B:3.6 mm、C:61 ℃，制備3 批樣品，分別測定黃精多糖質量分數，平均值為12.21%，與相應條件預測值相接近。結果表明，本研究所建立的數學模型準確可靠，滇黃精產地加工炮制一體化優(yōu)化工藝重復性好、可行性高、可操作性強。

3 討論

中藥材產地加工炮制一體化是原料到飲片且控制藥材質量的重要環(huán)節(jié)之一[1-2]。目前，產地加工仍處于傳統(tǒng)經驗指導操作，因此，對各步驟過程應做到科學、規(guī)范和標準，為中藥原料質量提供保障[3-5]。本研究對滇黃精蒸制時間、切片厚度、干燥溫度進行單因素考察，確定后續(xù)響應面分析各因素最高水平和最低水平。通過對黃精多糖含量測定，選擇蒸制時間22 min、切片厚度3.6 mm、干燥溫度61 ℃作為優(yōu)化工藝。按優(yōu)化工藝制備測定的黃精多糖實際值與預測值相接近。結果表明，本研究所建立的數學模型準確可靠，優(yōu)化后滇黃精產地加工炮制一體化工藝重復性好、可行性高、可操作性強，具有實際意義。滇黃精產地加工炮制一體化對滇黃精原料生產和飲片加工環(huán)節(jié)進行了優(yōu)化，能夠有效減少黃精多糖的損失、保證藥材質量，為中藥飲片、中藥制劑做好原料質量保障。