HPLC梯度洗脫法同時測定慢肝解郁膠囊中8種成分的含量△

沈曉慶，韋杏

1.遼寧中醫藥大學 附屬醫院 藥學管理部，遼寧 沈陽 110032；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001

慢肝解郁膠囊收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部，由柴胡、丹參、延胡索等13味中藥加工而成，主要用于肝區脹痛、胸悶不舒、食欲不振、腹脹便溏所屬肝郁脾虛癥、遷延性肝炎或慢性肝炎等病癥的治療[1]1685。臨床研究表明，慢肝解郁膠囊對慢性肝炎治療效果顯著[2]，其聯合復方鱉甲軟肝片能明顯減輕代償期肝硬化患者的臨床癥狀，改善肝纖維化程度，提高患者生存質量，提高臨床療效[3-4]。長期的臨床實踐證明，中藥及其制劑具有顯著的臨床療效，中藥不是單一的有效成分，其發揮療效的作用機制和單一化藥不同，具有多靶點、多成分、協同作用的特點，慢肝解郁膠囊現行質量標準[1]1684和文獻報道[5-6]中僅對其所含單成分芍藥苷、丹酚酸B分別進行測定，暫未檢索到對該制劑君藥柴胡及其他藥味所含多個指標成分進行同時控制的文獻報道，難以實現對慢肝解郁膠囊產品進行全面質量控制。本研究參考中藥質量標志物優選原則，首次采用高效液相色譜法(HPLC)梯度洗脫法對慢肝解郁膠囊所含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿含量進行同時測定，為更加全面地評價慢肝解郁膠囊的整體質量，指導藥品生產企業不斷優化生產工藝控制參數，確定原藥材產地來源、采收季節等提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；MS205DM型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥

對照品柴胡皂苷a(批號：110777-201912，純度：94.8%)、柴胡皂苷d(批號：110778-201912，純度：96.3%)、隱丹參酮(批號：110852-201807，純度：99.0%)、丹參酮ⅡA(批號：110766-201721，純度：99.5%)、延胡索乙素(批號：110726-201819，純度：99.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品丹參酮Ⅰ(批號：17051706，純度：99.9%)、紫堇堿(批號：17110821，純度：99.6%)均購自上海同田生物技術股份有限公司；對照品去氫紫堇堿(批號：CFS201901，純度：98.0%)購自武漢天植生物技術有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

慢肝解郁膠囊(規格：0.25 g/粒；批號分別為1904001、1905002、1907001)均來源于吉林敖東延邊藥業股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1對照品儲備液和混合對照品溶液制備 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對照品適量，精密稱定，用70%乙醇制成質量濃度分別為0.682、0.516、0.198、0.154、0.396、0.634、0.578、0.362 mg·mL-1的單組分對照品儲備液；精密吸取上述溶液各2.5 mL，用70%乙醇定容至50 mL，制成含柴胡皂苷a 34.1 μg·mL-1、柴胡皂苷d 25.8 μg·mL-1、隱丹參酮9.9 μg·mL-1、丹參酮Ⅰ 7.7 μg·mL-1、丹參酮ⅡA19.8 μg·mL-1、延胡索乙素31.7 μg·mL-1、去氫紫堇堿28.9 μg·mL-1、紫堇堿18.1 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液和陰性樣品溶液制備 取慢肝解郁膠囊內容物，取研細后細粉2.0 g，精密稱定，精密加入70%乙醇25 mL，稱質量，加熱回流提取30 min，放冷后用70%乙醇補足減失質量，濾過，制成慢肝解郁膠囊供試品溶液；按慢肝解郁膠囊處方和制法分別制備缺柴胡、缺丹參和缺延胡索的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗

色譜柱：Waters SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.1%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，25%A；10～18 min，25%～42%A；18～32 min，42%～65%A；32～47 min，65%～78%A；47～55 min，78%～25%A)，流速：1.0 mL·min-1；檢測波長分別為210 nm[7](0～18.0 min檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d)和280 nm[8-11](18.0～55.0 min檢測隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿)；進樣量：10 μL。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，進樣測定并記錄色譜圖。結果慢肝解郁膠囊中8種成分峰形對稱，理論塔板數按各成分峰計均≥4500，分離度均大于1.5，在與對照品相應的保留時間處，柴胡陰性樣品溶液色譜圖中未見柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色譜峰，丹參陰性樣品溶液色譜圖中未見隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA色譜峰，延胡索陰性樣品溶液色譜圖中未見延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿色譜峰，表明陰性樣品對慢肝解郁膠囊中8種成分的同時測定無干擾，見圖1。

注：A.混合對照品；B.慢肝解郁膠囊；C.柴胡陰性樣品(批號：1904001)；D.丹參陰性樣品；E.延胡索陰性樣品；1.柴胡皂苷a；2.柴胡皂苷d；3.隱丹參酮；4.丹參酮Ⅰ；5.丹參酮ⅡA；6.延胡索乙素；7.去氫紫堇堿；8.紫堇堿。圖1 慢肝解郁膠囊混合對照品、樣品及陰性樣品HPLC圖

2.3 線性關系考察

精密吸取2.1.1項下單組分對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用70%乙醇定容至20 mL，制成6個質量濃度梯度的線性考察混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿質量濃度見表1)，依法進樣測定，以待測成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表1。

表1 慢肝解郁膠囊中8種成分的線性考察混合對照品溶液質量濃度及線性關系考察結果

2.4 精密度考察

取混合對照品溶液連續進樣6次，測得柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿峰面積的RSD分別為0.56%、0.83%、1.12%、1.25%、1.01%、0.66%、0.71%和0.98%。

2.5 重復性考察

取同一批次慢肝解郁膠囊(批號：1904001)6份制備供試品溶液，依法進樣測定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，計算得8種成分含量的RSD分別為1.21%、1.44%、1.75%、0.87%、1.52%、1.36%、0.29%和1.60%。

2.6 穩定性考察

取同一份慢肝解郁膠囊(批號：1904001)供試品溶液，于0、2、4、8、12、18 h進樣檢測柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，結果慢肝解郁膠囊供試品溶液18 h內穩定，8種成分峰面積的RSD分別為0.57%、0.79%、1.10%、1.19%、0.97%、0.64%、0.73%和0.95%。

2.7 加樣回收率試驗

取含量已知的慢肝解郁膠囊(批號：1904001)樣品適量，傾出內容物研細，取9份，每份1.0 g，精密稱定，精密加入根據慢肝解郁膠囊各成分含量配制的混合對照品溶液(柴胡皂苷a 0.378 mg·mL-1、柴胡皂苷d 0.296 mg·mL-1、隱丹參酮0.118 mg·mL-1、丹參酮Ⅰ 0.084 mg·mL-1、丹參酮ⅡA0.236 mg·mL-1、延胡索乙素0.352 mg·mL-1、去氫紫堇堿0.324 mg·mL-1、紫堇堿0.196 mg·mL-1)0.5、1.0、1.5 mL各3份，再按2.1.2項下方法制成供試品溶液，依法進樣檢測柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，計算各成分的加樣回收率及RSD，結果見表2。

表2 慢肝解郁膠囊中8種成分的加樣回收率試驗結果

續表2

2.8 樣品含量測定

取3批的慢肝解郁膠囊樣品適量，按2.1.2項下方法每批制備3份供試品溶液，依法進樣測定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，計算各成分的含量，結果見表3。

表3 慢肝解郁膠囊樣品含量測定結果 mg·g-1

3 討論

3.1 指標成分的選擇

慢肝解郁膠囊由柴胡、延胡索、當歸、香櫞、白芍、川楝子、丹參、白術、茯苓、甘草、三棱、麥芽、薄荷13味中藥配伍而來，方中柴胡疏肝解郁、升舉陽氣，為君藥；延胡索、香櫞、川楝子理氣疏肝、活血止痛，當歸、白芍養血和血、柔肝疏肝，合為臣藥；丹參、三棱活血行氣、消積止痛，白術、茯苓健脾祛濕、益氣和中，薄荷疏肝行氣，麥芽健脾和胃，合為佐藥；甘草調和諸藥，為使藥。諸藥合奏，以達疏肝解郁、健脾養血之功。本研究參考中藥質量標志物確認原則，選取慢肝解郁膠囊君藥柴胡代表性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，臣藥延胡索活性成分延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，佐藥丹參[12]特征成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA為檢測指標成分，以期更加全面地評價慢肝解郁膠囊的內在質量。

3.2 供試品提取方式的確定

考慮到慢肝解郁膠囊方中柴胡、丹參、延胡索、當歸、薄荷、三棱、茯苓均細粉直接入藥，超聲提取難以使待測成分提取完全，故采用加熱回流的提取方式對樣品進行處理。參考相關文獻，對比考察了不同提取溶劑(70%乙醇[10，13]、水[7]、75%甲醇[8-9]、甲醇[11，14-16])對待測成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿綜合提取率的影響，結果70%乙醇為提取溶劑時，所測成分綜合提取率最佳。對提取時間不斷摸索，最終按照2.1.2項下方法對慢肝解郁膠囊進行供試品溶液的制備。

本研究采用HPLC同時測定慢肝解郁膠囊中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的含量，方法專屬性強、操作便捷、結果準確，為更加全面地評價慢肝解郁膠囊內在產品質量提供了數據支持。