毛栓菌27-1漆酶對酚酸類化合物降解的效能分析

周 鑫，繆曉磊，余學軍

（浙江農林大學/省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州 311300）

0 引言

雷竹(Phyllostachysviolascens)是浙江省筍用竹子主載品種，種植面積占浙江總竹林面積的10%左右，已發(fā)展了稻草、礱糠、麥麩等多種覆蓋集約種植模式[1-2]，為浙江省蔬菜市場提供了價格實惠、質量優(yōu)良的食用筍來源[3]。然而隨著雷竹種植集約化規(guī)模的無序擴大、覆蓋度的增加，超出種植容量，土壤酚酸類化合物增加，導致土壤酸化，土壤退化日益嚴重。據報道，富陽、臨安等地部分雷竹林土壤已到達pH 4.0，全年覆蓋竹林地土壤總酚酸含量約高于無覆蓋竹林地1.2～3.0倍，已嚴重制約雷竹產業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展[4]。毛栓菌是較有效降解木質素的微生物之一，能在純系培養(yǎng)中通過分泌漆酶將木質素降解成CO2和H2O[5]。漆酶在木質素分解過程中起著重要作用，以O2為電子受體催化多酚化合物，經單電子傳遞形成酮及自由基的含銅蛋白酶[6]，廣泛的底物特異性使其對土壤中多環(huán)芳烴(PAHs)[7]、多氯聯(lián)苯[8]、苯胺類廢水[9]等難降解污染物也具有催化降解作用。因此，極其有必要研究漆酶對酚酸類化合物的降解特性，以便更好地應用于雷竹林經營，促進竹產業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。目前對漆酶的研究主要集中在高產菌株的篩選和發(fā)酵優(yōu)化及漆酶對木質素的生物降解等方面[10-12]。漆酶在木質素降解[12]、有機染料的降解[13]、有機污染物的轉化[8]等方面已有應用研究，也有用于連作土壤修復[14]的研究報道。筆者團隊前期篩選獲得了1株優(yōu)良的毛栓菌菌株Trametes hirsuta27-1，發(fā)現(xiàn)其產漆酶能力較強且產生的漆酶具有較高的穩(wěn)定性[15]。為深入了解該菌株發(fā)酵產漆酶對酚酸類化合物的降解效能，以丁香酸為酚酸類化合物的代表，采用液相色譜分析法，篩選丁香酸降解最佳條件的漆酶活性。優(yōu)化漆酶活性的條件，提高漆酶對酚酸類化合物丁香酸降解效能，從而為雷竹林土壤酚酸類化合物降解的綜合應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗采用的毛栓菌27-1屬于真菌，是由李新鑫等篩選鑒定的白腐真菌，該菌株通過真菌的ITS序列測定和比對，確定為擔子菌綱多孔菌科栓菌屬的毛栓菌(Trameteshirsuta)[15]。該菌株漆酶活性可達94.39 U，在4℃保存，30℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。酚酸類化合物包括阿魏酸、香草酸、丁香酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、龍膽酸、原兒茶酸、芥子酸、對香豆酸、咖啡酸，購自上海源葉生物科技有限公司。

實驗使用的超高效液相色譜儀UPLC(1260 Infinity II Prime LC)、色譜柱 Agilengt EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×150mm，100 MPa)由美國安捷倫公司生產。

實驗于2019年10月—2020年9月在浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室進行。

1.2 酶液制備

在裝液量為150 mL的250 mL三角瓶中接種12.5%的種子液，在30℃的條件下，以200 r/min的轉速發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基接種培養(yǎng)7天后取適量的發(fā)酵液，在4℃下以8000 r/min離心10 min，取上清液為粗酶液，4℃保存。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，蒸餾水1 L，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酒石酸銨0.2 g/L，NH4NO30.1 g/L，麩皮8 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，CaCl21 g/L，微量元素液60 mL，醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)0.01 mol/L。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準工作溶液的配制 分別稱取適量阿魏酸、丁香酸、對羥基苯甲酸、香草酸、綠原酸、龍膽酸、原兒茶酸、芥子酸、對香豆酸和咖啡酸標準品，用80%甲醇溶解，配制成濃度均為500mg/L的母液，再用超純水稀釋，配制濃度分別為 0.01、0.1、10、20、40、100、200、500 mg/L的標準工作溶液。

1.3.2 超高效液相色譜分析

（1）色譜條件。柱溫左25℃、右25℃，進樣量2μL，流動相0.5%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15min 2%～25%B；15～20 min 25%～40%B)，流速 0.6 mL/min，DAD紫外檢測波長274 nm和320 nm。酚酸類化合物的檢測波長及保留時間分別為香草酸274 nm、8.145 min；丁香酸274 nm、8.902 min；對羥基苯甲酸274 nm、6.735 min；原兒茶酸274 nm、4.744min；綠原酸320nm、7.533min；龍膽酸320nm、6.179min；芥子酸320 nm、12.235 min；對香豆酸320 nm、10.793 min；咖啡酸320nm、8.440min；阿魏酸320nm、12.025min。標準品色譜圖見圖1。

圖1 10種酚酸標準樣品和供式菌液處理樣品色譜圖

（2）線性考察。對1.3.1節(jié)配制的混合標準工作溶液，按照1.3.2節(jié)的色譜方法進行分析，以峰面積Y為橫坐標、標準品進樣量X為縱坐標，計算10種酚酸線性回歸方程（表1）。在線性范圍內，此方法進樣量與峰面積線性關系良好。

表1 化合物的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍

（3）精密度實驗。精密吸取標準工作溶液，進樣2μL，連續(xù)進樣6次，在1.3.2（1）色譜條件下測定標準工作溶液的峰面積。10種酚酸面積的相對標準偏差(RSD)都小于0.5%，表明儀器的精密度良好。

（4）穩(wěn)定性實驗。精密吸取標準工作溶液，在室溫環(huán)境下分別放置0、2、4、8、12、18、24 h，在1.3.2色譜條件下，記錄峰面積，原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸峰面積的RSD分別為0.589%、0.658%、0.652%、0.851%、1.025%、0.685%、1.245%、0.689%、0.785%、1.065%，說明本實驗樣品在24 h內穩(wěn)定性良好，可進行多次檢測。

（5）重復性實驗。取同一標準樣品的5份，按1.3.2（1）色譜條件測定峰面積。測得10種酚酸的峰面積RSD＜5%，重復性良好。

（6）加樣回收率實驗。精密取同一已知酚酸含量的發(fā)酵菌酶液樣品3份，每份5.0 mL，分別加入0.5、1、1.5 mL混合標準工作溶液，按1.3.2（1）色譜條件測定，記錄峰面積，原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸的平均加樣回收率分別為98.36%、104.24%、98.27%、102.79%、105.43%、101.56%、103.62%、97.24%、99.12%、102.35%，本方法準確度可靠。

1.3.3 漆酶降解酚酸類物質的效能檢測 取粗酶液10 mL和定量的酚酸（濃度為10 mg/L）于50 mL錐形瓶放入30℃、200r/min恒溫搖床培養(yǎng)降解，24 h內每隔2 h取樣測定降解液中酚酸殘留率[式(1)]。

式中，ct為t時刻酚酸濃度(mg/L)，c0為初始酚酸濃度(mg/L)。采用1.3.2（1）的超高效液相色譜條件分析，檢測降解體系中的酚酸類化合物的變化，在UPLC測定各組分含量前，樣品需要過0.45 μm微孔濾膜注入進樣瓶。

1.3.4 不同降解條件下漆酶降解丁香酸的效能檢測 采用0.10 mg/L HCl或NaOH調節(jié)降解液的初始pH，分別在降解液初始為pH 3、4、5、6、7的條件下，于30℃下探究不同初始pH對毛栓菌27-1漆酶降解特性的影響；在初始pH 5的條件下，設置溫度分別為10、20、30、40、50℃，探究不同溫度對毛栓菌27-1漆酶降解特性的影響；在初始pH 5、培養(yǎng)溫度30℃的條件下，將降解液中丁香酸濃度設置為0.1、1、10、100、500 mg/L，探究不同初始酚酸濃度對毛栓菌27-1漆酶降解特性的影響。

催化介體可有效提高漆酶降解能力，采用不同濃度的ABTS溶液作為介體物質，在30℃、初始pH 5、香草酸濃度10mg/L的條件，設置ABTS溶液的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L，探究不同濃度介體ABTS溶液對毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響。

式中，c1為殘留酚酸濃度(mg/L)，c0為初始酚酸濃度(mg/L)。設置對照組，以滅活的酶液和同體積的超純水重復實驗。

1.3.5 漆酶活性測定 采用以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為反應底物的方法測定，室溫為25℃，反應體系3 mL，反應底物為2 mL的溶解于0.1 mmol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)緩沖液中的濃度為0.5 mmol/L的ABTS，加入1 mL的酶液啟動反應，測定最初3 min內420 nm處的吸光值變化。定義每分鐘氧化1 μmol的ABTS為一個酶活單位[ε=3.6×104L/(mol·cm)][16]。

2 結果與分析

2.1 毛栓菌27-1漆酶降解酚酸類物質的效能檢測

在30℃、pH 5條件下漆酶對10種酚酸類化合物的降解效能如圖2所示。毛栓菌27-1漆酶可有效降解香草酸、咖啡酸和芥子酸，3種酚酸在8 h內能被完全降解，開始的降解速率較低，2 h后對3種酚酸降解速率顯著提升，6 h時咖啡酸殘留率不到10%。說明毛栓菌27-1漆酶對香草酸、咖啡酸和芥子酸有良好的降解效果。

圖2 毛栓菌27-1漆酶對不同酚酸底物的降解效能

毛栓菌27-1漆酶對丁香酸、阿魏酸和龍膽酸降解轉化效率一般，通過12 h處理后，前兩者殘留率分別還有47.41%和49.67%，降解轉化了近一半，而龍膽酸的降解效果較差，殘留率還有68.21%。在24 h后（圖2中未標注出24 h殘留率），丁香酸、阿魏酸和龍膽酸的殘留率分別為47.32%、48.98%、65.56%，與12 h的殘留率差異不顯著。

原兒茶酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸和綠原酸在12 h和24 h的殘留率分別為87.30%、96.23%、93.31%、99.84%和86.40%、96.23%、92.76%、99.65%，表現(xiàn)出除原兒茶酸外，毛栓菌27-1漆酶對其他3種酚酸幾乎沒有降解效果。說明毛栓菌27-1漆酶產生的漆酶對酚酸種類降解效能具有差異性。

2.2 不同降解條件下漆酶降解丁香酸的效能檢測

根據2.1節(jié)毛栓菌27-1漆酶對10種酚酸類化合物的降解情況，以降解率居中(50%)的丁香酸為代表，進一步分析毛栓菌27-1漆酶對丁香酸降解的最優(yōu)組合條件。丁香酸對生態(tài)環(huán)境有一定危害，有報道丁香酸對植物種子萌發(fā)和幼苗生長有印制作用[17]。因此，更有必要深入探究漆酶在溫度、pH、初始濃度和介體ABTS溶液等外界不同條件對其的降解效能。

在30℃、自然pH條件下，對比滅活粗酶液、粗酶液和超純水對丁香酸的降解效能（表2），可分析出漆酶是主要降解因素。

表2 不同液體對丁香酸降解效能（殘留率） %

2.2.1 不同溫度對漆酶降解效能的影響 從圖3可以看出，在20、30、40℃條件下均有降解效果，在降解24 h后的殘留率分別為70.69%、44.63%和56.48%。而在50℃時，毛栓菌27-1漆酶幾乎對丁香酸沒有降解效果。在低溫，如10℃時24 h后丁香酸殘留率87.25%，雖有一定降解效果，但效果較差。參照漆酶酶活的變化，24 h后酶活隨著溫度的升高而降低，推測低溫雖然維持了毛栓菌27-1漆酶的活性，但不利于降解，高溫會顯著降低漆酶活性，抑制降解。在30℃時毛栓菌27-1漆酶表現(xiàn)出最優(yōu)降解效果。毛栓菌27-1漆酶降解丁香酸的效能與溫度的關系呈倒U曲線。

圖3 不同溫度對毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響

2.2.2 不同初始pH對漆酶降解效能的影響 從圖4可知，在中性和酸性下，菌株對丁香酸都有一定的降解效果。在初始pH 5時，12 h和24 h后殘留率分別為47.41%、47.32%，無顯著差異，表現(xiàn)出最好降解效果。在初始pH 3、4、6、7時，降解24 h后的殘留率分別為65.56%、50.64%、75.46%、70.85%，在4 h開始表現(xiàn)出降解效果后，到24 h殘留率都為持續(xù)下降，而pH 5時在12 h就達到最低殘留率。在初始pH 3、4、5、6、7時，24 h后漆酶活性依次為78.18、81.65、80.55、77.25、75.54 U，可見初始pH對漆酶活性降低影響不大。所以該菌株在pH 5時，降解效果達到最佳。

圖4 不同初始pH對毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響

2.2.3 不同初始濃度丁香酸對漆酶降解效能的影響 從圖5可知，在丁香酸初始濃度過低(0.1 mg/L)的降解條件下，未觀察到明顯的降解現(xiàn)象。在1、10、100 mg/L的丁香酸濃度條件下，毛栓菌27-1漆酶對丁香酸具有良好的降解效果，24 h后的殘留率分別為43.35%、43.84%、45.54%。在1mg/L的初始濃度時，8 h后的殘留率為50.64%，已有較好降解效果。而在高濃度(500 mg/L)的降解條件下，丁香酸雖然減少，但不顯著，24 h后殘留率仍有90.44%。在低濃度時，24 h后漆酶活性降低程度差異不大，在500 mg/L濃度時顯著降低，表明高濃度酚酸會降低毛栓菌27-1漆酶的活性。所以毛栓菌27-1漆酶對較低濃度丁香酸降解效果不明顯，而高濃度丁香酸對毛栓菌27-1漆酶的降解能力有抑制作用。

圖5 不同初始濃度丁香酸對毛栓菌27-1漆酶降解效能的影響

2.2.4 不同濃度介體ABTS溶液對漆酶降解效能的影響 如圖6所示，毛栓菌27-1漆酶對丁香酸的降解率隨著ABTS溶液濃度增大而提高，在不使用ABTS溶液作為介體時，降解率只有52.68%，而在0.5 mmol/L濃度時，降解率達到100%。在無ABTS溶液時的降解率與其他各濃度條件下的降解率都存在顯著差異性。表明加入ABTS介體物質后丁香酸的降解效果顯著提升。

圖6 不同濃度介體ABTS溶液對毛栓菌27-1降解效能的影響

3 結論與討論

真菌漆酶的催化底物較為廣泛，主要包括酚類和芳香類化合物[18]。酚酸類化合物指在一個苯環(huán)上有多個酚羥基取代的芳香羧酸類化合物[19]，由不同酚羥基取代形成不同種類。在酚酸類底物中，漆酶對于底物的降解主要產生自由基，產物不穩(wěn)定，可進行二次酶催化氧化和非酶促反應，如水合、歧化和聚合[20]，進而降解去除。本實驗所探究的毛栓菌27-1產生的漆酶對酚酸類化合物降解表現(xiàn)出差異性，其能完全降解香草酸、咖啡酸和芥子酸，不能降解香豆酸、對羥基苯甲酸和綠原酸，對其他幾種酚酸類化合物降解效果不同，這可能與酚酸類物質苯環(huán)母核上的取代基不同相關，例如羧基、羥基和甲氧基等取代基類型及位置，也與毛栓菌27-1的漆酶本身特異性相關。

理化性質是影響漆酶對酚酸降解的重要因素[21]，主要包括溫度、pH等。一般真菌漆酶的最適反應溫度在25～50℃之間，本實驗結果最適溫度為30℃，雖然低溫條件可較好維持粗酶液中漆酶酶活，但不利于降解反應，說明反應效果不僅由酶活高低決定。現(xiàn)在也有較耐高溫真菌漆酶的報道，Marasmiusquercophilus漆酶[22]在75℃條件下半衰期為10 min；pH也是影響酶活性的關鍵因素之一，雖然多數(shù)真菌漆酶的最適反應在pH 4.0～6.0，但不同漆酶間最適pH可能不同，同一種漆酶的作用底物也有所不同，所以其最適pH存在差異。理化性質會影響毛栓菌產漆酶的能力，本實驗探究降解效能運用的是粗酶液，為避免菌體的影響，后續(xù)可深入探究用菌體直接培養(yǎng)降解酚酸。

小分子介體存在常常對漆酶跟酚酸類化合物的聚合作用有抑制，而此時漆酶對這類化合物的降解作用則起主要作用[8]，介體可以起橋梁的作用，首先由漆酶氧化后再進行介體引導底物的氧化。常見的介體有ABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、HBT(1-hydroxybenzotriazole)、NHA(N-hydroxyacetanilide)、3-hydroxyanthranilicacid 和 VIO(violuricacid)等[23-25]。漆酶介體體系(LMS)目前有較多研究報道，在生物燃料、綠色有機物合成、食品工業(yè)、生物傳感器、生物檢測等領域都有應用[26]。伴隨著介質體系的深入研究，漆酶能催化底物的范圍將進一步擴大，漆酶的應用領域及其價值也將得到進一步的發(fā)展和提高。本實驗中利用ABTS溶液作為介體物質，可大大提高毛栓菌27-1漆酶對酚酸的降解能力。