以小鼠腎小管IMCD3細胞株探討纖毛生成和上皮細胞極化的關系

謝淳安

研究背景

大多數的動物細胞具有纖毛。纖毛主要由外層的膜包覆中心的微管所組成，中心的微管稱為軸絲，軸絲是由母親中心粒當作基體作為地基，向上構筑成雙聯體九排的微管，并環繞成圓柱形的構造，而基體上的遠程附器和細胞膜結合，使纖毛向外長出細胞表面。纖毛發生病變可導致多種疾病，如原發性支氣管炎、肝臟和腎臟的多囊性增生等，由此可看出纖毛對于許多細胞的功能具有極大的影響力。

纖毛的生成路徑有2 種：細胞內和細胞外路徑。小鼠腎小管IMCD3 細胞株的纖毛是借由細胞外路徑生成，細胞外路徑就是在一般二維培養的情況下，可觀察到母親中心粒移動到細胞膜附近，再向外長出纖毛;視網膜色素上皮細胞株和成纖維細胞株的纖毛則是借由細胞內路徑，在此路徑中，母親中心粒維持在細胞中心的位置就可直接長出纖毛。

在極化的上皮細胞中，纖毛發育的過程起始于母親中心粒，必須從細胞核附近移動到細胞頂端膜附近，再由遠程附器結合在頂端膜上，作為基體向細胞頂端長出纖毛，凸出頂端膜表面以感測細胞外界訊號。然而，在細胞外路徑中，母親中心粒是如何移動至頂端膜附近？其如何辨別細胞頂端和底端的方向性？這些分子機制仍然不清楚。

研究方法

本研究以小鼠腎小管IMCD3 細胞株， 在去血清的刺激誘導下， 使IMCD3 細胞長出纖毛，再以免疫熒光染色分析閉鎖小帶與生成纖毛的關系。并利用克隆形成實驗，將IMCD3 細胞株分為4 類形態，也進一步發現在三維培養中，4 種細胞形態皆無法排列成空腔構造。最后建立載體DNA，以綠色熒光標示纖毛蛋白，在活細胞中追蹤基體的移動及纖毛生成的過程。期望通過研究纖毛形成的過程機理，能探討致病的作用機制，找出治療纖毛病變的方法。

結果與討論

具完整閉鎖小帶的細胞通常同時具有纖毛

為了探討纖毛生成的機制，首先利用免疫熒光染色法觀察IMCD3 細胞株，結果發現有完整閉鎖小帶結構的細胞比沒有閉鎖小帶的細胞更容易形成纖毛。在正常10% 胎牛血清培養液的條件下培養，可發現有一些具有閉鎖小帶的細胞已經長出纖毛。當細胞培養在去血清的條件下，細胞會停止增生，離開細胞周期，進入G0 期，誘發更多纖毛生成。去血清的培養結果顯示，經染色發現有長纖毛的細胞大部分都具有細胞和細胞之間完整的閉鎖小帶結構，同時具有纖毛與閉鎖小帶的細胞與同時不具二者的細胞比例最高，因此推測在IMCD3 細胞中，纖毛的生成和閉鎖小帶的結構有密切關聯。

具完整閉鎖小帶的細胞，纖毛生長基部到細胞底端的距離較長，且纖毛生長在細胞頂端

經免疫熒光染色發現，有完整閉鎖小帶構造的細胞，纖毛會長在細胞頂端，玻片底部到纖毛基部的距離較長;反之，在破碎閉鎖小帶構造的細胞中，一些有纖毛生成的細胞，其纖毛比較靠近細胞底部和玻片貼附的區域，顯示纖毛未生長在正常的位置。在染有Arl13B和ZO1 的細胞中，自細胞底端至纖毛生長位置基部的距離有完整閉鎖小帶的細胞，纖毛基部到細胞底端的距離平均大于沒有完整閉鎖小帶的細胞。

另外，纖毛的生成位置對其功能可能造成影響，沒有長在細胞膜頂端上的纖毛可能會使細胞無法正常接收訊號，導致疾病。而有完整閉鎖小帶可以讓細胞的極性呈現出來，進而引發細胞上下徑的延長，并使纖毛生長在細胞頂端;反之，具有破碎閉鎖小帶的細胞可能無法顯現極性，因而使纖毛無法生長在正確位置。由此結果我們推論，閉鎖小帶結構的完整性可能和細胞外路徑的纖毛生成方式有關。

具完整閉鎖小帶的細胞能形成立體的空腔構造，且分裂具有正確的方向性

空腔構造中的細胞具極性：在可見光下IMCD3 細胞的空腔細胞在三維培養細胞系統中，可以看到有空腔的細胞群占有九成的比例。以更原始的IMCD3 細胞進行三維培養，觀察細胞形成空腔構造的比例，結果發現大多數細胞能形成完整空腔構造。

在空腔構造中，細胞分裂有固定的方向性：因為IMCD3 細胞屬于單層細胞構成的球體，為了維持細胞整體的極性，細胞在分裂時會沿著閉鎖小帶的切線方向分開。在分裂過程中，中心粒會移動到細胞的兩極。因此在細胞分裂時，纖毛不會出現在細胞頂端膜上。如果細胞向外或向內分裂，分裂出去的細胞可能會死亡。

細胞密度的增加不能增加閉鎖小帶的完整性

在顯微鏡下，將IMCD3 分為4 種形態，4 種細胞群的排列方式皆不同，編號由小到大為細胞排列疏松到緊密。在前面的實驗中，我們觀察到IMCD3細胞株具有2 類細胞：具完整閉鎖小帶和具破碎閉鎖小帶。關于這2 類細胞的關系，我們推測有2 種可能：一是隨著細胞生長、細胞密度增加，破碎閉鎖小帶可發育成完整閉鎖小帶，二是這個細胞株混合了不同特性的細胞群。為了分辨兩種可能性，我們設計克隆形成實驗，挑選單一性質的克隆。

以赫斯特染色染活細胞的細胞核，可看出4 個細胞株皆沒有長出空腔。我們推論可能與細胞繼代的次數有關，因為在原始的細胞株中仍能找到長空腔的IMCD3 細胞。

我們先確認微絲和閉鎖小帶的位置關系，發現具閉鎖小帶的細胞和不具閉鎖小帶的細胞之間的界線沒有因為細胞密度增加而消失，反而更加明顯。由這個實驗我們推論閉鎖小帶不會因為細胞密度增加而改變原有的形態，所以這4 種形態的細胞可能是具不同特性的細胞群。

纖毛的生成和母親中心粒有關

以綠色熒光標示纖毛蛋白，搭配紅色熒光標示母親中心粒，以便于活細胞追蹤基體的移動及纖毛生成過程。將制作好的質體感染進細胞中，可以看到纖毛以母親中心體為基底，向外長出纖毛。為了確認是否可以成功標示纖毛，以免疫熒光染色標記母親中心體，確認位置。

結論與應用

本實驗目前的初步結論如下。

??具完整閉鎖小帶的細胞通常同時具有纖毛。

??具完整閉鎖小帶的細胞，纖毛生長基部到細胞底端的距離較長，且纖毛生長在細胞頂端。

??具完整閉鎖小帶的細胞能形成立體的空腔構造，且分裂具有正確的方向性。

??細胞密度的增加不能增加閉鎖小帶的完整性。

??纖毛的生成和母親中心粒確實有關。

閉鎖小帶如何影響細胞極性和纖毛生成呢？我們認為閉鎖小帶和細胞極性的關系可能和磷脂酰肌醇有關，已表現極性的細胞，其頂端細胞膜含有PIP2，基體可以辨別PIP2，而在頂端的位置長出纖毛，極性細胞的底端細胞膜則含有PIP3，這兩類的磷脂酰肌醇分布受到閉鎖小帶的限制，不會相混。沒有閉鎖小帶的細胞因為細胞膜上頂部和底部的磷脂酰肌醇位置同時混在細胞膜上，可能使基體無法分辨頂端，因而在細胞內長出纖毛。

目前的研究結果顯示小鼠腎小管IMCD3 細胞株的纖毛形成和閉鎖小帶的形成有關聯性。這個研究結果不僅對于了解纖毛的生成有幫助，也有助于找出纖毛突變所引發疾病的治療方法。未來我們會運用活細胞影片實際拍出纖毛生成的過程，也會探討母親中心體、高基氏體和纖毛形成的關系，希望能更了解纖毛生成的路徑及機制，提供治療相關疾病的可能方向。

專家評語

細胞纖毛發育缺陷是多種疾病成因之一，但許多情況下其致病機理并不清楚，該項目以小鼠腎小管的細胞株為模型，探討纖毛缺陷的致病機理。本項目證實具備完整閉鎖小帶的細胞通常同時具有纖毛，實驗完整，有明確研究目的和顯著創新。