馬氏珠母貝酶解蛋白粉營養組成及其對斑馬魚學習記憶能力的影響

魏 偉，朱國萍,2，章超樺,2，高加龍,2，曹文紅,2，鄭惠娜,2，秦小明,2

（1.廣東海洋大學食品科技學院// 2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室// 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室// 國家貝類加工技術研發分中心(湛江)，廣東 湛江 524088）

學習記憶能力的基礎是神經元的突觸可塑性。隨著全球老齡化的加劇，與學習記憶相關的腦健康問題愈發凸顯，導致家庭與社會的負擔日益加重[1]。衰老過程中促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 等長期刺激可導致慢性、低度、微炎性等炎性衰老狀態[2]。相關研究表明，衰老可觸發激活腦部的免疫細胞——小膠質細胞分泌促炎癥細胞因子，炎性衰老狀態損傷神經元突觸結構長時程增強，從而引起學習記憶能力衰退甚至導致神經退行性疾病[3-5]。Mcgeer等[6]發現，通過抑制慢性炎癥反應可以改善由衰老引起的學習記憶能力衰退，進而提升老年人的生活質量。

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）是我國海水珍珠養殖的主要品種，主要分布于日本和我國南海沿岸，其營養豐富，產量巨大，是一種尚待開發的海洋資源[7]。據報道，馬氏珠母貝酶解產物具有抗衰老[8]、抗炎[9]、增強免疫[10]、抗氧化[11]、抗疲勞[12]等多種生物活性。但是關于馬氏珠母貝酶解產物改善學習記憶能力的功效研究報道較少。本研究通過分析馬氏珠母貝酶解蛋白粉營養組成，以自然衰老斑馬魚作為動物模型，飼喂馬氏珠母貝酶解蛋白粉，比較其T 迷宮行為學以及生物指標的變化，探究馬氏珠母貝酶解蛋白粉對衰老斑馬魚（Daniorerio）空間學習記憶能力的改善作用，旨在為馬氏珠母貝酶解蛋白粉改善老年記憶功能衰退的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物

馬氏珠母貝酶解蛋白粉（Enzymolysis protein powder ofPinctada martensii，EPP），廣東海洋大學食品科技學院預制酶解蛋白粉。

6 月齡和18 月齡的斑馬魚，體長分別為2.5～3.0 cm、2.8～ 3.3 cm，購于上海乙諾水族科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

BCA 蛋白質定量試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；斑馬魚白細胞介素1β（IL-Iβ）試劑盒，（批號20190702-95471A）、斑馬魚腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒（批號20190702-95472A）、斑馬魚白細胞介素 10（IL-I0）試劑盒（批號：20190702-96083A）、斑馬魚腦源性神經營養因子（BDNF）試劑盒（批號：20190702-98030A），江蘇酶免實業有限公司。

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、鹽酸、硼酸、苯酚、無水葡萄糖、石油醚等試劑均為分析純。

SZF-06A 脂肪測定儀，上海洪紀儀器設備有限公司；組織研磨儀，卡尤迪生物科技有限公司；SL1-700 恒溫孵育箱，上海愛朗儀器有限公司；Multiskan FC 酶標儀，美國 Thermo 公司；ZEBRALAB 魚類高通量實驗監控系統，法國Viewpoint life sciences 公司；T 型迷宮，法國Viewpoint life sciences 公司。

1.3 方法

1.3.1馬氏珠母貝酶解蛋白粉的制備 采用課題組預制馬氏珠母貝酶解蛋白粉進行實驗。酶解工藝條件參照課題組前期優化條件[13]。

1.3.2馬氏珠母貝酶解蛋白粉基本營養成分的測定 水分測定采用常壓干燥法按GB 5009.3—2016測定；灰分測定采用高溫灼燒法按GB 5009.4—2016 測定；粗蛋白質測定采用凱氏定氮法按GB 5009.5—2016 測定；粗脂肪測定采用索氏抽提法按GB 5009.6—2016 測定；總糖測定采用苯酚-硫酸法按GB/T 9695.31—2008 測定。

1.3.3馬氏珠母貝酶解蛋白粉氨基酸組成測定氨基酸組成采用氨基酸分析儀按GB5009.124—2016 測定。

1.3.4馬氏珠母貝酶解蛋白粉金屬含量測定 鈣、鐵、鋅、硒、銅、錳含量測定采用微波消解-電感耦合等離子體-質譜法按GB 5009.268—2016 測定。

1.3.5實驗動物分組及給藥 所有的斑馬魚置于14 h 光照/10 h 黑暗的循環中（光照階段從7：00 am開始），控制溫度（25±2）℃、空氣濕度（60±5）%，養殖用水是曝曬兩周后的自來水。不同年齡段的斑馬魚被盛于不同的長方形水箱（35 cm×24 cm×20 cm）中，水箱配備過濾、溫控裝置，密度1.5 尾/L。

將40 尾18 月齡斑馬魚隨機分成兩組，每組20尾。另取20 尾6 月齡斑馬魚作為對照。分為對照組（6 月齡飼料喂養）、模型組（18 月齡飼料喂養）、實驗組（18 月齡飼料按3.0 g/kg 劑量拌喂EPP）3組。適應性喂養兩周（14 d）后，進行連續分組飼養30 d，每天一次。實驗組EPP 飼喂量參照《保健食品檢驗與評價技術規范（2003 年版）》[14]按人體推薦劑量20 倍，3.0 g/kg 進行實驗。

1.3.6斑馬魚T 迷宮試驗 參照葡韻竹[15]的方法并適當改進。本試驗所用 T 型迷宮由水平等長的左右臂和垂直輔道組成。材料均為白色不透明的塑料板，以避免外界顏色對斑馬魚行為學產生影響。在測試期，T 迷宮與ZEBRALAB 魚類高通量實驗監控系統聯合使用。該試驗分適應期與測試期兩個階段，為期5 d，試驗期間不喂食。

行為學適應期在實驗開始的31 d 上午9 點開始進行。將整組斑馬魚輕緩地放入T 迷宮中適應2 h，并保證這段時間內右臂一直有食物存在，以給予斑馬魚獎賞刺激，形成記憶。適應期未有數據。

行為學測試期從實驗開始的32 d 上午9 點開始進行。每組斑馬魚20 尾，逐尾進行測試。在轉移斑馬魚的過程中，實驗人員應盡量動作溫柔輕緩，以免對行為學結果產生影響。并且每尾待測魚在測試前需在安靜無干擾環境放置5 min 作預處理。在測試期間，斑馬魚在迷宮中的運動由帶有紅外檢測功能的攝像機監控，攝像機位于迷宮正上方1.5 m處，并連接在一臺計算機上，便于實驗人員觀察斑馬魚的運動。

測試時，將準備好的斑馬魚放入垂直輔道起點處，并開始5 min 計時。當斑馬魚進入右臂，并且持續時間大于或等于30 s 時，即認為這尾斑馬魚成功進入食物放置區，此時在右臂對斑馬魚進行食物獎賞，斑馬魚從放入起點到進入右臂的時間為潛伏期；若斑馬魚未成功進入右臂，計時結束后引導其進入右臂投喂食物，停留3 min，使斑馬魚將右臂與食物獎勵形成聯系，其潛伏期計為300 s。每條魚測試結束后，系統自動導出斑馬魚運動軌跡，可用于計算右臂游動路程占比。

測試結束后，將斑馬魚放到提前備好的魚缸中，進行下一條魚的測試。當整組魚測試結束后，一起放回原來的水箱。

行為學測試每天一次，持續4 d。在剔除不游動的斑馬魚后，統計斑馬魚進入食物放置區（右臂）的成功率、潛伏時間、右臂游動路程占比。

1.3.7腦組織樣本的制備 將完成行為學試驗的斑馬魚于次日上午在冰水混合物中低溫麻醉后稱重，按順序放置于冰面上，用眼科鑷打開被固定斑馬魚的頭蓋后，完整將全腦取出，將魚腦分析天平稱重并記錄，盛裝于預先備好的離心管，為保證樣品量3 個斑馬魚腦組織作為一個樣品（n=6，其余兩個魚腦組織用作試劑盒濃度預實驗），在液氮中急凍后，放于-80 ℃冰箱，用于后續指標測定。

將凍存的魚腦解凍后，按照質量體積比1∶9加入磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）后，進行組織勻漿，勻漿液在3 000 r·min-1，4 ℃條件下離心10 min，取上清，轉移至新離心管后，凍存于-80 ℃冰箱，備后續生物化學指標測定。

1.3.8斑馬魚腦組織炎癥因子及神經營養因子測定 采用斑馬魚IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF 試劑盒測定魚腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF含量，具體操作嚴格參照說明書。采用BCA 蛋白質定量試劑盒測定實驗樣品蛋白含量，具體操作嚴格參照說明書。

1.4 數據統計分析

實驗數據除行為學結果外均以平均值±標準差表示，行為學結果以平均值±標準誤差表示。采用獨立樣本t檢驗對數據進行組間差異顯著性分析，行為學成功率采用卡方檢驗進行比較。顯著水平α=0.05。采用JMP Pro 13 進行數據分析，Origin Pro 9.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 EPP 基本營養組成分析

EPP 基本營養組成見表1，EPP 粗蛋白質量分數高達78.28%，粗脂肪質量分數1.96%，總糖質量分數3.88%，水分質量分數5.87%，灰分質量分數11.59%。同水解牡蠣(Crassostrea rivularis)粉（粗蛋白52.40%、粗脂肪1.09%、總糖12.00%、水分14.20%、灰分17.20%）[16]相比，具有高蛋白特點。

表1 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的基本營養組成Table 1 Contents of basic component in EPP %

2.2 EPP 氨基酸組成分析

對EPP 氨基酸進行分析，結果見表2。結果顯示EPP 氨基酸種類齊全，含量豐富。尤其是天冬氨酸、谷氨酸質量分數（以蛋白粉為基礎）很高，分別達到8.87、13.00%，兩者占總氨基酸比例28.21%，均高于牡蠣酶解產物含量[17]。EPP 的主要氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸。EPP的疏水性氨基酸質量分數為28.39%，疏水性氨基酸占總氨基酸比例為36.62%，高于牡蠣酶解產物組分（31.04%）[18]。

表2 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of EPP %

2.3 EPP 金屬元素含量分析

EPP 金屬含量測定結果見表3，所測定的金屬元素（以蛋白粉為基礎）中Ca 質量分數最高，達725.54 mg/kg，占全部測定元素的86.32%。EPP 除Ca 含量很高外，還含有較高的Fe 和Zn 元素，質量分數分別為55.80、48.71 mg/kg，以上3 種元素占全部測定元素的98.75%。另外EPP 還含有較低量的錳、銅、硒元素，質量分數分別為5.16、3.14、2.19 mg/kg。

表3 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的金屬元素含量Table 3 Metal element content of EPP mg/kg

2.4 EPP 對斑馬魚體質量的影響

在實驗動物生長發育期，體質量的增長情況是反映動物健康狀況最基本的指標之一[19]。因此可通過測量比較實驗后斑馬魚的質量對EPP 進行初步食用安全性評價。

各組斑馬魚體質量見圖1，經比較，各組斑馬魚體質量無顯著差異（P＞0.05）。各組斑馬魚體質量分別為：對照組（0.52±0.09）g、模型組（0.54±0.13）g、實驗組（0.59±0.12）g。這初步表明，EPP 對斑馬魚的正常生長無影響，是一種安全的海洋食品原料。

圖1 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚體質量的影響Fig.1 Effect of EPP on the body weight in zebrafish

2.5 EPP 對斑馬魚行為學的影響

T 迷宮試驗結果見圖2。總體而言，從行為學測試開始，對照組、模型組、實驗組斑馬魚的覓食成功率、潛伏期、右臂游動路程占比在3、4 d 均趨于穩定和一致，這可能是因為行為學測試過程中對斑馬魚記憶的鞏固強化所致，因此在接下來分析中中僅描述和討論1～ 2 d 的行為學結果。與對照組相比，模型組1～ 2 d 成功率未有顯著差異（P＞0.05）；與模型組相比，實驗組1、2 d 成功率均顯著升高（P＜0.05）（圖a）。與對照組相比，模型組潛伏期1、2 d 略高（P＞0.05）；與模型組相比，實驗組潛伏期明顯降低（P＞0.05）（圖b）。與對照組相比，模型組右臂游動路程占比1、2 d 未有顯著差異（P＞0.05）；與模型組相比，實驗組占比1、2 d 均顯著升高（P＜0.05）（圖c）。行為學結果表明，實驗組斑馬魚學習記憶能力強于模型組。綜上所述，EPP可以有效改善自然衰老斑馬魚的學習記憶能力。

圖2 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚行為學的影響Fig.2 The effects of EPP on zebrafish behavioristics

2.6 EPP 對斑馬魚腦組織炎癥因子含量的影響

EPP 對斑馬魚腦組織炎癥因子含量的影響見表4，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織IL-1β、TNF-α 含量顯著上升（P＜0.05），表明衰老導致了斑馬魚腦部炎癥反應的增強；與模型組相比，實驗組斑馬魚腦組織IL-1β、TNF-α 含量顯著下降（P＜0.05），說明EPP 能夠抑制促炎細胞因子的產生，具有顯著的體內抗炎作用，表明EPP 對衰老斑馬魚學習記憶能力的改善作用可能與其抑制神經炎癥有關。另外，各組斑馬魚腦組織中IL-10 含量均無顯著差異（P＞0.05），但可見模型組斑馬魚腦組織IL-10 含量較高。

表4 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚腦組織炎癥因子質量分數的影響Table 4 Effects of EPP on the content of inflammatory factors in zebrafish brain tissue pg/mg

2.7 EPP 對斑馬魚腦組織腦源性神經營養因子含量的影響

EPP對斑馬魚腦組織BDNF含量的影響見圖3，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織中BDNF 的含量無顯著變化（P＞0.05）；與模型組相比，實驗組斑馬魚腦組織中BDNF 含量顯著升高（P＜0.05）。各組斑馬魚腦組織BDNF 質量分數別為：對照組（389.18±37.38）、模型組（392.39±26.89）、實驗組（447.38±48.32）pg/mg。這表明，EPP 可以提高自然衰老斑馬魚腦組織中的BDNF 含量。

圖3 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚腦組織BDNF含量的影響Fig.3 Effect of EPP on the content of BDNF in zebrafish brain tissue

3 討論

學習記憶能力會受到衰老的顯著影響，是最先衰退的認知功能之一[20]。衰老伴隨的自由基氧化會通過促進神經細胞內炎癥小體的形成、誘導MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）磷酸化、活化NF-κB（調節促炎細胞因子分泌的核轉錄因子），導致大腦慢性炎癥，進而損傷宿主的學習記憶能力[21-23]。本研究結果表明，EPP 中蛋白質量分數高達78.28%，經酶解后，含有大量的低分子肽。氨基酸測定結果表明，EPP 含有豐富的酸性氨基酸（Glu、Asp）和疏水性氨基酸，分別占總氨基酸的28.21%、36.62%。酸性氨基酸可作為氫供體中和自由基的氧化性；疏水性氨基酸可提高小分子肽在體內水-脂界面的溶解度，提升抗氧化能力，EPP 可能通過抗氧化途徑抑制炎癥反應、提高學習記憶能力[24]。另外，金屬元素含量測定結果表明，EPP 含有豐富的Ca、Fe、Zn 元素。金屬元素在人體中主要以酶輔基或直接參與的形式影響包括學習記憶在內的所有生命活動，孫艷等[25]研究發現Zn 預處理可以降低LPS 誘導的小膠質細胞炎癥，補充Zn 可能對學習記憶有改善作用。從EPP 的營養組成來看，其可能具有通過抗氧化途徑或直接作用改善大腦炎癥狀況，提升學習記憶能力的功效。

衰老會導致包括斑馬魚在內的脊椎動物學習記憶能力下降，且衰老斑馬魚學習記憶能力的衰退可通過行為學試驗進行評估[26-27]。T 迷宮是從嚙齒類動物向斑馬魚學習記憶研究工具轉化的經典范例，其在簡單的設備和較少的學習成本條件下即可評估斑馬魚的學習記憶能力[28]。在迷宮試驗中，予以斑馬魚食物獎勵刺激是常用的刺激方式之一[29]。本研究采用T 迷宮行為學方法，分析斑馬魚的覓食成功率、潛伏期、右臂游動路程占比以評估斑馬魚的學習記憶能力。結果顯示，與對照組相比，模型組斑馬魚覓食成功率偏低而潛伏期偏高，呈現出學習記憶能力的損傷趨勢；與模型組相比，實驗組斑馬魚在行為學測試期1～ 2 d 的覓食成功率（P＜0.05）、右臂游動路程占比（P＜0.05）、潛伏期表現全面提升，表明EPP 可以明顯改善自然衰老斑馬魚的學習記憶能力。

學習與記憶的基礎是突觸可塑性，包括新突觸的形成、神經元重塑、新神經元的生成[30]。突觸可塑性衰退的中心活動是中樞神經系統的免疫激活，即神經炎癥[31]。小膠質細胞是一種存在于腦組織的主要免疫細胞，衰老條件下會發生活化，激活的小膠質細胞可以極化為兩種不同的表型：M1 型和M2型[32]。M1 型極化是一種有害表型，其特征在于促炎因子（IL-1β、TNF-α 等）的高表達，反映腦組織炎癥狀況。IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子，可直接抑制LTP（引起突觸可塑性改變的主要形式），造成記憶能力下降[33]，對神經細胞的發育和存活產生不利影響[34]；IL-1β、TNF-α 也可能通過降低BDNF表達量，損傷學習記憶能力[30,35]。M2 型極化是一種有益表型，其特征在于BDNF 和抑炎因子（IL-10等）的表達[32]，BDNF 是一種廣泛存在于大腦的蛋白質，與神經再生、空間學習和記憶相關，可以通過誘發LTP、促進神經元發育和存活而影響記憶的形成，與神經元的突觸可塑性呈正相關[33,36]。IL-10是一種抗炎細胞因子，可以促進神經細胞增殖，降低其它促炎細胞因子水平。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織中IL-1β、TNF-α含量均顯著上升（P＜0.05）、BDNF 含量無明顯差異；在EPP 飼喂后，與模型組相比，實驗組斑馬魚腦組織中的IL-1β、TNF-α 含量均顯著下降（P＜0.05）、BDNF 含量顯著升高（P＜0.05）。表明EPP對神經炎癥有抑制作用，其可通過緩解神經炎癥、提高BDNF 含量來改善衰老斑馬魚學習記憶能力。斑馬魚腦組織IL-10 含量各組之間的差異并不顯著（P＞0.05），但模型組斑馬魚腦組織中IL-10、BDNF含量的相對增加，表示斑馬魚大腦可能因衰老而觸發的適應性機制，自身會通過適當的抗炎反應來補償炎癥水平的加劇。Song 等[37]的研究也表現出斑馬魚在逆環境中的IL-10 和BDNF 上升。值得注意的是，雖然與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織中的IL-1β、TNF-α 含量顯著升高，但是與對照組相比，模型組斑馬魚并未表現出更差的行為學結果，這可能是由于6 月齡和18 月齡斑馬魚對環境變化的不同敏感程度造成的。Remy 等[38]對環境富集條件下青年和衰老斑馬魚的行為學進行研究，所得結果與本研究一致。

EPP 改善自然衰老斑馬魚學習記憶能力的功效可能是基于酶解產生的肽類物質或者包括金屬元素在內的其它組分，也可能是所有成分共同作用的結果。其改善學習記憶的物質基礎還需進一步探究，另外，本研究雖在參考文獻基礎上采用EPP 3.0 g/(kg·d) 的飼喂劑量，發現EPP 具有改善自然衰老斑馬魚學習記憶能力的功效，但是其具體的量效關系仍然未知。因此，在本研究基礎上，對不同劑量的EPP 分離組分改善衰老斑馬魚學習記憶能力的探討將作為下一步工作的重點。

4 結論

EPP 是一種高蛋白、氨基酸種類齊全，富含金屬元素的優質海洋食品原料。飼喂EPP 30 d 后，自然衰老斑馬魚進入T 迷宮右臂的成功率、潛伏期及右臂游動路程占比均有明顯改善，腦組織中IL-1β、TNF-α 含量顯著降低，BDNF 含量升高。表明EPP 具有改善自然衰老斑馬魚學習記憶能力的功效，其機制可能與EPP 緩解斑馬魚腦組織炎癥狀況、提高腦源性神經營養因子水平有關。