骨髓間充質干細胞來源的外泌體對弗氏完全佐劑誘導類風濕性關節炎大鼠的治療作用

范愛玉，謝衛勇，駱芳茗，范愛霞

1深圳市龍崗區骨科醫院，廣東深圳 518116；2北京中醫藥大學深圳醫院（龍崗）

類風濕性關節炎（RA）的病理表現主要為滑液中出現炎性細胞浸潤，滑膜細胞增生引起免疫反應異常，導致關節軟骨及骨持續性破壞［1］。全球范圍內，RA的患病率為0.4%～1.3%，到2015年，超2 400萬人患有RA［2-3］。目前RA的治療手段包括非留體抗炎藥（NSAIDs）、傳統慢性抗風濕藥、糖皮質激素類、生物制劑和基因治療等［4］。但以上方法只能減輕RA患者臨床癥狀和體征，毒副作用大，不能根治炎癥。因此，尋求新的治療方法具有重要意義。骨髓間充質干細胞（BMSC）是一種重要的成體多能祖細胞，具有低免疫原性、遺傳背景穩定等特點，可以分化為骨骼、軟骨和脂肪組織［5］。研究報道，同種或異種間充質干細胞（MSC）移植對膠原誘導的關節炎小鼠具有明顯的治療作用，但其潛在作用機制尚不清楚［6-7］。外泌體（Exo）內含有各種蛋白質、脂類、mRNA、miRNA和DNA片段等物質，在疾病的早期預防、診斷以及預后判斷方面有重要意義［8］。因此，本研究從BMSC中分離獲得Exo（BMSC-Exo），以弗氏完全佐劑（CFA）誘導的SD大鼠為研究對象，評價BMSC-Exo在CFA誘導RA大鼠中的治療作用，從而為Exo臨床治療RA提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及試劑 陽性對照藥物塞來昔布（Cel）購于深圳市龍崗區骨科醫院（批準文號：國藥準字J20120063）；p-P65、P65、p-P50、P50、p-IκBα、IκBα、CD63、TSG101、CM130、GAPDH一抗和HRP標記的羊抗兔二抗購于CST公司；大鼠BMSC（貨號：RAWMX-01001）和OriCell大鼠骨髓間質干細胞完全培養基（貨號：RAWMX-90011）均購于賽業（蘇州）生物科技有限公司；弗氏完全佐劑（貨號：F5881）購于Sigma-Aldrich公司；BioLegend LEGENDplex多因子檢測試劑盒（#740150）購于BioLegend公司，其余試劑均購于Sigma-Aldrich公司。

1.2 大鼠BMSC培養 大鼠BMSC培養于OriCell大鼠BMSC完全培養基，置于37oC、5%CO2培養箱中，當BMSC達到80%～90%匯合時，進行傳代培養。

1.3 實驗動物 SPF級SD大鼠20只，雄性，體質量（250±20）g，購于廣東省醫學實驗動物中心，生產合格證號：SCXK（粵）2019-0035；飼養于20～24oC、空氣相對濕度40%～60%的環境中，房間保持12 h晝夜節律，大鼠自由飲水和進食。實驗中所有操作遵循廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會的相關規定。

1.4 實驗方法

1.4.1 Exo提取及鑒定 將大鼠BMSC細胞培養上清液在4oC條件下，300～500 g離心10 min，去除死細胞及細胞碎片，然后2 000 g離心10 min去除生物聚合物以及凋亡小體，吸取上清經10 000 g離心30 min去除大型囊泡，最后利用超速離心機（Beckman，德國）在100 000 g下超速離心60 min，在沉淀中加入50μL的PBS，待沉淀溶解后分裝至小EP管待用，于-80°C保存。用1×PBS將Exo稀釋2倍，利用馬爾文納米顆粒跟蹤分析儀（Nanosight NS300，英國）和相應軟件檢測并分析Exo的粒徑大小。BMSC-Exo特異性標志分子為Exo膜蛋白（CD63）、Exo內蛋白（TSG101），不能有細胞質蛋白CM130表達。將提取到的Exo加入含1μg/mL PMSF和1μL磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液中冰上裂解45 min（體積比為1∶1），離心后取上清用Pierce?BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將上清與5×上樣緩沖液混合均勻，100oC煮10 min，上樣20μg蛋白，調節電壓至80 V，待溴酚蘭剛跑出分離膠底部即可終止電泳。然后將PAGE凝膠放于半干式轉膜儀（BioRad，美國），恒壓15 V條件下轉膜2 h，5%奶粉封閉2 h，TBST緩沖液洗3次，每次5 min。分別加入抗體稀釋液稀釋的一抗（CD63 1∶1 000；TSG101 1∶1 000和CM130 1∶1 000），4oC條件下孵育過夜。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（HRP-IgG 1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗滌后，加入ECL顯影液，在化學發光成像系統（BioRad，美國）曝光顯影并利用該凝膠圖象處理系統分析其灰度值。

1.4.2 CFA誘導大鼠RA模型的建立 20只SPF級大鼠，隨機分為Sham組、CFA組、Exo組和Cel組，每組5只。將0.1 mL CFA皮下注射到CFA組、Exo組和Cel組大鼠左后肢足跖部，注射7 d后左側足趾關節開始出現腫脹，Sham組注射等體積生理鹽水。Exo組按照10 mg/kg劑量尾靜脈注射BMSC-Exo，每周注射1次，連續注射3周，Cel組按照3 mg/kg劑量每天灌胃1次Cel，連續給藥3周；Sham和CFA組大鼠注射相同體積的生理鹽水。

1.4.3 體質量測定 于CFA注射之日（第0天）及CFA注射后第7、14、21、28天，分別稱量各組大鼠的體質量。

1.4.4 足趾關節腫脹度測定 于CFA注射之日（第0天）及CFA注射后第7、14、21、28天，利用電子游標卡尺分別測定各組大鼠足跖厚度。

1.4.5 關節炎指數（AI）評價 利用5級評分法對大鼠踝關節進行評分，按照每個踝關節的炎癥從輕到重評為0～4分；大鼠AI大于4分，則認為建模成功。具體評分如下：無關節炎癥狀為0分；關節內出現紅色斑點或踝關節出現輕度紅腫（紅斑和輕度腫脹局限于足中段或踝關節）為1分；踝關節出現中度紅腫（紅斑和輕度腫脹從踝關節蔓延至足中段）為2分；全爪嚴重紅腫（紅斑和輕度腫脹從踝關節蔓延至關節）為3分；關節嚴重腫脹并伴有功能障礙（紅斑和重度腫脹包括踝、足和趾）為4分。

1.4.6 熱痛閾測定 利用熱輻射刺激測痛儀測定大鼠熱刺激縮足反射潛伏期（PWTL）評價大鼠熱敏痛。大鼠處于自由活動狀態，儀器刺激強度設定為IR=72，將大鼠左后肢放在儀器上，記錄鼠爪移動時的反應時間，即大鼠足底部的PWTL。

1.4.7 行為學檢測 曠場裝置（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司）為80 cm×80 cm×60 cm，實驗在一個相對較暗的環境下進行，實驗時將大鼠輕輕放入曠場的正中央，讓大鼠適應5 min，然后自主攝影大鼠的自發活動，連續記錄5 min，利用相關軟件統計分析大鼠整個自主運動的總距離。采用自動步態分析系統進行測試［9］，參數設定：傳送帶速度為12 cm/s，拍照快門速度為40 ms，每只動物記錄6 s。實驗終點前連續訓練3 d，每天1次，每只動物每次跑步1 min。連續給予Exo或Cel 3周后進行正式測試，DigiGait軟件自動識別爪腳印，分析步長、步寬、前后肢角度變化等步態參數。

1.4.8 免疫評價 大鼠經異氟烷麻醉后，取出脾臟，生理鹽水漂洗后用濾紙吸干表面水分并稱重（濕質量），計算脾臟指數。脾臟指數=器官濕質量（g）/大鼠體質量（g）。

1.4.9 血清中炎癥因子水平測定 大鼠經異氟烷麻醉后，眼球取血，室溫靜止30 min，4oC條件下600 g離心10 min，分離出上層血清，用稀釋液將血清稀釋2倍用于流式檢測。根據BioLegend LEGENDplex多因子檢測試劑盒操作說明，利用流式細胞儀（BD Accuri C6，美國）檢測血清中IL-1α、TNFα、IL-1β、IL-6、IFNβ和GM-CSF。

1.4.10 關節組織中NF-κB通路相關蛋白檢測 采用Western blotting法檢測各組關節組織中的p-P65、P65、p-P50、P50、p-IκBα和IκBα蛋白（稀釋比例均為1∶1 000）。

1.5 統計學方法 應用Graphpad prism8.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素或雙因素方差分析，進行Tukey's檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSC-Exo的粒徑及表面分子 納米顆粒跟蹤分析儀結果表明，BMSC-Exo的粒徑分布在82.5 nm處達到峰值。Western blotting結果顯示，BMSC-Exo特異性表達CD63和TSG101分子，但不表達CM130，見圖1。

圖1 BMSC-Exo表征分子的Western blotting檢測結果

2.2 各組CFA注射后不同時間體質量比較 見表1。

2.4 各組CFA注射后不同時間足趾關節腫脹度比較 見表2。

表1 各組CFA注射后不同時間體質量比較（g，-x±s）

表2 各組CFA注射后不同時間足趾關節腫脹度比較（mm，-x±s）

2.5 各組脾臟指數和AI比較 見表3。

表3 各組脾臟指數和AI比較（±s）

表3 各組脾臟指數和AI比較（±s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與CFA組比較，#P＜0.05。

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表4 各組站立次數、運動距離比較（±s）

表4 各組站立次數、運動距離比較（±s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與CFA組比較，#P＜0.05。

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2.8 各組步態參數比較 見表5。

表5 各組步態參數比較（±s）

表5 各組步態參數比較（±s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與CFA組比較，#P＜0.05。

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2.9 各組血清炎癥因子水平比較 見表6。

2.10 各組NF-κB信號通路相關蛋白表達比較 見表7。

表6 各組血清炎癥因子水平比較（pg/mL，-x±s）

3 討論

RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病［10］。研究發現IL-6、TNFα和IL-1β等促炎因子在RA中能引起炎癥反應和導致關節破壞［11］。在大鼠足趾部皮下注射CFA，可以刺激機體免疫細胞增殖，引起免疫功能異常增高，產生針對關節滑膜的自身免疫反應。此模型存在明顯的免疫異常，是一種典型的免疫性炎癥模型，早期表現為局部炎癥，后期滑膜增生，最終造成不可逆的關節損害。由于CFA模型造模簡便，發病周期較短，與RA患者臨床癥狀（四肢腫脹、運動障礙、體質量減少和炎性反應等）接近，因此該模型在RA的治療和防治藥物研究中應用廣泛［12］。本研究發現，CFA誘導的大鼠足趾關節腫脹度、AI和炎性反應明顯增加，大鼠體質量和熱痛閾顯著降低，這與既往研究報道相一致［13］。RA中炎癥引起的軟骨及骨骼異常、滑膜組織和周圍肌肉及神經異常，均可導致步態障礙［14］，本研究發現CFA誘導的大鼠同樣出現明顯的運動障礙。

目前，現有的臨床藥物尚不能完全治愈RA，只能緩解RA的進展，而且長期使用會出現感染和骨質疏松等不良反應。當前某些治療RA的生物藥，如針對TNFα的蛋白質或抗體，可有效減輕RA癥狀，但仍不能逆轉疾病病程；盡管新的基因療法已在臨床前和臨床研究中顯示出治療RA的前景，但用于治療大量RA患者是否安全有效仍不清楚［15］。Cel作為新一代非甾體抗炎鎮痛藥，通過選擇性抑制環氧化酶-2（COX-2）抑制前列腺素生成，達到抗炎和鎮痛效果。本研究發現Cel可降低CFA誘導大鼠AI和提高熱痛閾，這與Cel在多種臨床前RA模型及關節炎患者中減少慢性炎癥結果相一致。但值得注意的是，Cel長期服用會產生胃腸道不適、潰瘍和出血等不良反應，且只能緩解臨床癥狀。MSCs可對參與先天性和適應性免疫應答的多種細胞發揮免疫調節作用。近年來MSCs在治療RA方面取得了一定的進展，但在臨床前及臨床研究中顯示存在一定的治療風險。近年來，Exo被證明在細胞間具有免疫調節特性，在包括RA在內的炎性和自身免疫性疾病的動物模型中顯示出有效的治療作用［16-17］，重要的是Exo可以降低MSCs的潛在治療風險。本研究發現BMSC-Exo可明顯改善CFA誘導大鼠足趾關節腫脹度、降低AI、提高熱痛閾和降低脾臟指數，這與MSCs-Exo減輕骨性關節炎動物的骨關節炎相關癥狀一致［18］。值得注意的是，BMSC-Exo的總體治療效果優于Cel（無統計學差異，可能與各組大鼠數目不足有關），可能是因為BMSC-Exo通過多種途徑發揮抗RA效果，而Cel僅作用于COX-2發揮抗炎效果。NF-κB是RA中炎癥的關鍵調節劑［19］。最近的研究表明，NF-κB還廣泛參與RA中滑膜細胞異常凋亡和成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖［20］。本研究結果顯示BMSC-Exo和Cel明顯降低CFA大鼠血清中炎癥因子的表達和減少關節組織中P65、P50和IκBα的磷酸化水平，表明BMSC-Exo抑制NF-κB活性降低炎性反應，這與BMSC-Exo降低膠原誘導RA大鼠炎癥反應［21］的結果相一致。但Exo組分復雜，目前對BMSC-Exo組分在RA中的作用機制尚不清楚，還需要進一步研究。

表7 各組NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（±s）

表7 各組NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（±s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與CFA組比較，#P＜0.05。

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綜上所述，BMSC-Exo可以通過降低CFA誘導的炎性因子減緩RA大鼠的病程和改善運動障礙。進一步探索BMSC-Exo中的何種物質發揮其免疫調節作用，并據此將其應用于RA的治療，具有良好的臨床應用前景，有望為RA的治療提供一種全新的治療途徑。