川陳皮素調控LINC00116對結直腸癌細胞生物學功能的影響

孫嘉偉，盧秀，王燕

1濟南市第四人民醫院，濟南 250031；2上海市浦東新區人民醫院

在全球范圍內，結直腸癌是最常見的癌癥類型之一［1］。在結直腸癌的早期階段（即Ⅰ、Ⅱ期），患者可以接受手術和治愈性治療，其5年生存率大于60%。但是，超過50%的患者發現時已處于晚期，發生遠處轉移的風險較高，而這些患者的5年生存率降至10%［2］。由于轉移被認為是癌癥治療失敗的主要原因，因此開發用于預防和治療癌癥轉移的新型藥物至關重要。川陳皮素是一種在柑橘類水果中發現的多甲氧基類黃酮，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗高血壓和抗菌等作用，對腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲表現一定的抑制活性［3-5］。研究發現，川陳皮素及其衍生物通過靶向癌癥進展中的多種途徑，阻滯細胞周期、抑制細胞增殖、誘導凋亡、防止腫瘤形成、減少炎癥作用和限制血管生成［6］，但其具體的作用機制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類大于200個核苷酸的非編碼RNA，研究發現lncRNA LINC00116在宮頸癌中高表達，敲除LINC00116可抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲［7］。然而，LINC00116在結直腸癌中的生物學作用研究較少。本研究觀察了川陳皮素對結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并對其潛在的分子機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 結直腸癌細胞HCT116購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司。細胞HCT116在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養，在37℃、5%CO2的環境中生長。川陳皮素（純度≥98%）購自成都曼斯特生物科技有限公司，磷脂酰結 合 蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司，二辛可寧酸（BCA）試劑盒購自上海碧云天公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、E-鈣黏蛋白（Ecadherin）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）一抗購自美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 細胞增殖情況觀察 采用MTT法。將細胞HCT116以1×104/孔的密度接種到96孔板中，并分別使用0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h。每孔加入100μL 0.5 mg/mL MTT溶液，在37℃保持4 h。將反應得到的沉淀物溶于100μL二甲基亞砜中，用酶標儀在490 nm處測定細胞光密度（OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=實驗OD值/對照OD值×100%。

1.3 細胞克隆形成檢測 采用克隆實驗。細胞HCT116以0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h，之后將細胞接種于60 mm培養皿，在新鮮培養基中繼續培養細胞10～14 d，每4～5 d更換1次培養基。當出現≥50個細胞集落時，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，甲醇固定20 min和吉姆薩染色30 min，統計克隆形成數。

1.4 細胞凋亡情況觀察 使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒對細胞凋亡進行評估。收集0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h的細胞HCT116。在細胞HCT116的單細胞懸液（1×106/mL）中加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，在室溫下于黑暗處孵育15 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 細胞遷移和侵襲能力檢測 細胞HCT116用0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理48 h，之后收獲細胞，以Transwell小室法檢測細胞的遷移和侵襲能力。檢測細胞侵襲時，Transwell上室用100μL的Matrigel膠包被，靜置3～4 h（檢測細胞遷移時不加Matrigel膠）。將細胞HCT116重懸于無血清RPMI1640培養基，制成1×106/mL的密度，接種100μL于Transwell上室，并在下室添加含10%胎牛血清的RPMI1640培養基。37℃培養24 h后，除去上室的Matrigel膠和細胞，甲醛固定和結晶紫染色，統計遷移、侵襲細胞數。

1.6 細胞中P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2蛋白檢測 采用Western blotting法。0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理細胞HCT116后，用預冷細胞裂解緩沖液冰上提取總蛋白，經BCA試劑盒定量，取30μg的蛋白在10%SDS-PAGE凝膠上分離，并轉移到PVDF膜，在5%脫脂牛奶中封閉1 h。然后用1∶1 000稀釋的P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2和GAPDH（對照）的一抗，在4℃下孵育過夜。TBST洗滌10 min，3次后將PVDF膜與辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育1 h，膜用TBST清洗10 min，3次后用增強的化學發光法顯影蛋白條帶。在ImageJ軟件中通過光密度分析法檢測P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2蛋白。

1.7 細胞中LINC00116表達檢測 采用實時熒光定量PCR。根據TRIzol試劑說明提取細胞HCT116的總RNA。參照TaKaRa公司Reverse Transcription Reagent試劑盒的步驟將總RNA反轉錄為cDNA。PCR反應使用引物和SYBR Green PCR試劑盒進行。LINC00116引物序列為5'-CATGGCGGATGTGTCAGAGA-3'（正向），5'-GCCTCCTTTTCCTCCAGTCC-3'（反向）；內參U6引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'（正向），5'-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3'（反向）。使 用2-ΔΔCt法 計 算LINC00116相對表達量。

1.8 細胞轉染 將細胞HCT116接種于6孔板，分為si-NC組、si-LINC00116組、NOB+pcDNA3.1組、NOB+pcDNA3.1-LINC00116組。細胞匯合至70%左右時，按照Lipofectamine2000試劑說明書的步驟，在細胞中分別轉染si-NC、si-LINC00116、pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00116。轉染24 h后，NOB+pcDNA3.1組、NOB+pcDNA3.1-LINC00116組使用40μg/mL川陳皮素處理48 h。依照1.2～1.7所述方法檢測各項指標。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 川陳皮素對細胞HCT116增殖、凋亡的影響見表1。

表1 不同濃度川陳皮素對細胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

表1 不同濃度川陳皮素對細胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

注：與0時相比，*P＜0.05。

?

2.2 川陳皮素對細胞HCT116遷移、侵襲的影響 見表2。

表2 不同濃度川陳皮素對細胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

表2 不同濃度川陳皮素對細胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

注：與0時相比，*P＜0.05。

?

2.3 川陳皮素對細胞HCT116中LINC00116表達的影響 0、10、20、40μg/mL川陳皮素處理細胞HCT116中的LINC00116相對表達量分別為1.02±0.10、0.78±0.08、0.56±0.05、0.34±0.03，川陳皮素減少細胞HCT116中LINC00116的表達（P均＜0.05）。

2.4 抑制LINC00116對細胞HCT116增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 si-NC組、si-LINC00116組LINC00116相對表達量分別為1.03±0.10、0.28±0.03，兩組相比P＜0.05。抑制LINC00116對細胞HCT116增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響見表3、4。

表3 抑制LINC00116對細胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

表3 抑制LINC00116對細胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

注：與si-NC組相比，*P＜0.05。

?

表4 抑制LINC00116對細胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

表4 抑制LINC00116對細胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

注：與si-NC組相比，*P＜0.05。

?

2.5 過表達LINC00116對川陳皮素作用的細胞HCT116增殖、凋亡的影響 NOB+pcDNA3.1組、NOB+pcDNA3.1-LINC00116組LINC00116相對表達量分別為1.00±0.10、2.36±0.23，兩組相比P＜0.05。過表達LINC00116對川陳皮素作用的細胞HCT116增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響見表5、6。

表5 過表達LINC00116對川陳皮素作用的細胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

表5 過表達LINC00116對川陳皮素作用的細胞HCT116增殖、凋亡的影響（±s）

注：與NOB+pcDNA3.1組相比，*P＜0.05。

?

表6 過表達LINC00116對川陳皮素作用的細胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

表6 過表達LINC00116對川陳皮素作用的細胞HCT116遷移、侵襲的影響（±s）

注：與NOB+pcDNA3.1組相比，*P＜0.05。

?

3 討論

結直腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，也是人類癌癥相關死亡的主要原因之一［8］。罹患結直腸癌的風險與個人特征或習慣（如年齡、慢性病史和生活方式）多種危險因素相關［9］。在臨床實踐中，手術、化療和放療仍然是結直腸癌的主要治療策略［10］。但是，結直腸癌患者的預后仍然很差，特別是對于轉移性結直腸癌患者［11］。因此，開發新的抗腫瘤藥物是結直腸癌管理策略的重點。天然化合物已被用于治療癌癥多年，其毒副作用比非天然抗癌藥物少。然而，天然來源的藥物缺乏特定的靶標［12］。因此，研究天然產物的靶向治療極具意義。本文研究了一種天然黃酮類化合物——川陳皮素，它可充當針對各種癌癥的抗癌劑。

以往的研究已經證明了川陳皮素在多種腫瘤細胞系和腫瘤模型如膀胱癌、肺癌和前列腺癌中的生長抑制作用［13-15］。川陳皮素的抗癌功能包括抑制增殖、遷移、侵襲和血管生成，如川陳皮素以劑量和時間依賴的方式抑制人鼻咽癌C666-1細胞的活力，以劑量依賴的方式誘導細胞凋亡［16］，還可顯著抑制鼻咽癌HONE-1和NPC-BM細胞系的遷移、侵襲能力，下調MMP-2表達［17］。川陳皮素的代謝物與他汀類藥物通過誘導G0/G1細胞周期停滯和凋亡而協同抑制人結腸癌細胞的生長［18］。本研究中，川陳皮素減少細胞HCT116的存活率、克隆形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數、MMP-2蛋白表達，提高細胞凋亡率及P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達，且作用效果隨濃度增加而逐漸增強。川陳皮素顯現出一定的抗結直腸癌活性，可以下調MMP-2和上調P21、Caspase-3、E-cadherin表達抑制結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡，進而發揮其抗腫瘤作用，這提示富含川陳皮素的藥物可能在結直腸癌的治療中有一定的前景。

lncRNA在多種細胞過程中發揮重要的調節作用，例如細胞增殖、凋亡、分化和侵襲［19］。隨著對結直腸癌發病相關分子機制的深入研究，lncRNA被認為是結直腸癌發生和發展的關鍵調控因子［20-22］。LINC00116是新發現的一種lncRNA，編碼高度保守的56個氨基酸的微蛋白［23］。LINC00116編碼連接呼吸和脂質代謝的線粒體肽［24］，與脊椎關節炎/強直性脊柱炎密切相關［25］，然而對于LINC00116的生物學功能研究較少。本研究發現，抑制LINC00116降低細胞HCT116的細胞存活率、克隆形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數、MMP-2蛋白表達，增加細胞凋亡率及P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達，表明抑制LINC00116可以抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與LAI等［7］的研究一致。同時，抑制LINC00116還可誘導結直腸癌細胞凋亡。可見LINC00116是一種促癌lncRNA，抑制其表達將有助于阻礙結直腸癌的惡性進展。為了揭示川陳皮素的抗腫瘤機制，在結直腸癌細胞中檢測了LINC00116的表達及作用。發現不同濃度的川陳皮素減少細胞HCT116中LINC00116的表達，提示調控結直腸癌細胞中LINC00116的表達可能是川陳皮素發揮抗腫瘤作用的重要途徑。此外，過表達LINC00116增加川陳皮素作用的細胞HCT116的細胞存活率、克隆形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數、MMP-2蛋白表達，降低凋亡率及P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表達。這些結果說明，川陳皮素抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導其凋亡的作用可能是通過下調LINC00116的表達來實現的。

綜上所述，川陳皮素可以抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導細胞凋亡。抑制LINC00116同樣具有抗結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，及促進細胞凋亡的作用。另外，川陳皮素抗結直腸癌活性與調控LINC00116的表達有關。這為結直腸癌的治療策略提供了新的線索。