電針時間對急性心肌缺血大鼠保護作用及心肌核轉錄因子-κB表達水平的影響

瞿巧鈺，童 艷，朱 超,王言玲，王 堃，吳生兵,周美啟

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；3.安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 236800)

冠狀動脈粥樣硬化型心臟病，是指冠狀動脈發生粥樣型硬化引起管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血低氧或壞死而引起的心臟病，簡稱“冠心病”，也稱“缺血性心臟病”。因冠狀動脈粥樣硬化導致的急性心肌梗死，其高發病率和高死亡率已成為全球面臨的公共衛生問題之一。中醫學關于針刺治療“胸痹”在《黃帝內經》中早有記載；現代臨床研究也表明，針刺能改善患者心電圖的心率、ST段改變、心絞痛程度，從而達到治療心肌缺血的目的。

核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)是一類關鍵的核轉錄因子，能調節多種炎癥遞質的表達，并且參與了細胞的生長、存活、分化、調亡，介導多種炎癥及免疫相關性疾病的病理過程。急性炎癥反應是缺血的一種表現，降低炎癥細胞因子水平以及減少白細胞浸潤能夠改善缺血癥狀。有研究發現，大鼠心肌缺血后心肌組織的NF-κB mRNA表達水平增加，表明NF-κB與心血管疾病密切相關。電針能夠減少細胞凋亡，減輕心肌缺血過程中的炎癥反應，起到保護心肌組織的作用。目前，關于電針時間對心肌NF-κB蛋白及mRNA表達影響的研究較少，本研究擬通過觀察缺血心肌組織中NF-κB蛋白及mRNA表達水平，探討電針介入時間對急性心肌缺血大鼠損傷保護作用的可能機制，為臨床治療此類疾病的時間量化提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物與分組 選取健康清潔級雄性大鼠50只，體質量(220±10)g，由安徽醫科大學飼養中心[生產許可證號：SCXK(皖)2017-001]提供，在康為IR60獨立送風隔離籠具內飼養，籠內溫度控制在(22±1)℃，相對濕度60%。自然光線，室溫環境下適應性喂養1周后，采用隨機數字表法將大鼠分為正常組、模型組、電針即刻組、電針1 d組、電針3 d組、電針5 d組、電針7 d組，每組6只。實驗中死亡8只，實驗過程中動物的處置符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.2 主要試劑與儀器 異氟烷：瑞沃德公司；異丙醇：上海蘇懿化學試劑有限公司；PBS緩沖液粉末、GAPDH：Proteintech；羊抗兔HRP標記二抗：上海碧云天；NF-κB：Abcam；Trizol：Invitrogen；DEPC處理水：基爾頓生物；SYBR Green PCR試劑盒：Thermo；逆轉錄試劑盒：Fermentas；肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、缺血修飾白蛋白(ischemia modified albumin，IMA)：江萊生物。

Powerlab 16導生理記錄儀：澳大利亞AD instruments公司；電泳儀(mini protean 3 cell)：BIO-RAD公司；電轉儀(PS-9)：大連競邁科技有限公司；水浴鍋(型號 HI1210)：萊卡公司；成像系統(Tanon-5200)：Tanon。Real-time PCR檢測儀：ABI公司；低溫冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；旋渦振蕩器：青浦瀘西儀器廠；電動勻漿機：FLUKO；酶標儀(型號 MK3)：芬蘭雷勃；華佗牌針灸針具；帶線縫合針(6-0)：上海金環醫療公司；SDZ-V電針儀：蘇州針灸用品廠。

2 方法

2.1 模型復制方法 模型組、電針組采用結扎心臟冠狀動脈左前降支法制備急性心肌缺血模型，將大鼠放置麻醉誘導箱中，使用5%異氟烷誘導麻醉1 min后放于實驗臺上仰臥位固定四肢，面罩吸入1%異氟烷維持麻醉狀態。無菌操作備皮后鈍性分離左胸皮下筋膜、肌肉，止血鉗鈍性穿破第4、5肋間后擠出心臟，于左心耳下緣2～3 mm冠狀動脈左前降支處以6-0帶線縫合針進針結扎，心臟復位，擠出胸腔殘余空氣后縫合且予青霉素鈉噴灑傷口防止感染，復制模型后使用電生理記錄儀記錄肢體Ⅱ導聯心電圖，以ST段弓背抬高作為評判急性心肌缺血模型是否復制成功的標準。

2.2 干預方法 參照《實驗針灸學》結合以往的研究成果進行腧穴定位，選取手少陰心經“神門-通里”段。在大鼠左右腕部各刺入3根0.30 mm×25 mm的一次性無菌針灸針，間距為2 mm，連接電子針療儀，疏密波，電流強度為1 mA，頻率為2 Hz，每次30 min，即刻電針組在模型復制完成后立即予以電針1次，電針1 d組在模型復制后第2天時干預1次，電針3 d組連續干預3 d，電針5 d組連續干預5 d，電針7 d組連續干預7 d，每日1次。而正常組和模型組不予電針處理。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 心電圖檢測 使用PowerLab Systems記錄肢體Ⅱ導聯心電圖，將電極刺于大鼠左后、右前與右后肢皮下，記錄心電圖，根據ST段抬高情況，判斷是否成功復制急性心肌缺血模型。

2.3.2 ELISA法檢測血清CK、CK-MB、IMA水平 將大鼠麻醉后腹主動脈取血于采血管內，放入冷凍離心機中3 500 r/min離心10 min。離心后取上清液放入凍存管中，放于-80 ℃冰箱保存待測。具體方法按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測血清血清CK、CK-MB、IMA水平。

2.3.3 Western blot 法檢測大鼠心肌組織NF-κB蛋白表達水平 將心肌組織取出，4 ℃下采用裂解液[

V

(RIPA)∶

V

(PMSF)=100∶1]充分裂解細胞，蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱，用于檢測NF-κB蛋白表達水平。電泳分離蛋白樣品，濃縮膠75 V，20 min，分離膠115 V，75 min。當染料到達膠底部時切斷電源，停止電泳，進行下一步轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉NC膜2 h，一抗膜室溫孵育，4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1 h，洗膜3次。ECL試劑盒化學發光顯影，用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

2.3.4 熒光定量PCR法檢測大鼠心肌組織NF-κB mRNA表達水平 取心肌組織剪碎研磨于1 mL的Trizol的勻漿管中，于勻漿機勻漿20 s提取總RNA。加入40 μL的DEPC水溶解RNA，置于-80 ℃冰箱保存備用。后反轉錄為cDNA，反應程序：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min；4 ℃，5 min；置于-20 ℃保存。將制備好的cDNA進行PCR擴增。PCR擴增：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；0 ℃，45 s；40個循環。上下游引物序列見表1。以GAPDH基因作為內參基因，采用2-ΔΔC法分析NF-κB mRNA的相對表達水平。

表1 PCR引物序列及擴增長度

3 結果

3.1 模型復制前后大鼠心電圖變化 正常組ST段電壓為(0.134 3±0.004 64)mV，模型組ST段電壓為(0.274 3±0.014 62)mV，與正常組比較，模型組大鼠的ST段電壓抬高≥0.1 mV(

P

<0

.

05)，表明急性心肌缺血大鼠模型復制成功。3.2 各組大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平顯著升高(

P

<0

.

05)；與模型組比較，即刻電針組大鼠血清IMA水平差異無統計學意義(

P

>0

.

05)，CK、CK-MB水平顯著降低(

P

<0

.

05)，其余各電針組大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平逐漸降低，以電針7 d組降低最為顯著(

P

<0

.

05)。見表2。

表2 各組大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平比較

3.3 各組大鼠心肌組織NF-κB蛋白及mRNA表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白及mRNA表達水平顯著升高(

P

<0

.

05)；與模型組比較，即刻電針組、電針1 d組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白及mRNA差異無統計學意義(

P

>0

.

05)；電針3 d、5 d、7 d組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白及mRNA表達水平呈下降趨勢，以電針7 d組下降最為顯著(

P

<0

.

05)。見圖1、表3。

注：A.正常組；B.模型組；C.即刻電針組；D.電針1 d組；E.電針3 d組；F.電針5 d組；G.電針7 d組

表3 各組大鼠心肌組織NF-κB蛋白及mRNA表達水平比較

4 討論

急性心肌缺血可歸屬于中醫學“胸痹”“心痛”“真心痛”等范疇。病位在心，主要病機為心脈痹阻。由于心脈閉塞，氣血運行中斷，心胸猝然大痛，而發為真心痛。心主血脈，能夠主管脈動和推動血液的運行。《靈樞·經脈》記載，手少陰心經“起于心中，出屬心系……下肘內，循臂內后廉，抵掌后銳骨之端”，是動則病“心痛”；又言其“是主心所生病者”。由此可知手少陰心經循行、病候和主治與心密切相關。《靈樞·九針十二原》記載：“五臟有疾，當取十二原。”神門穴為心經輸穴和原穴，主治心病，現代常用于治療心絞痛等疾病。針刺心經原穴對心功能的調節具有相對特異性，可以有效治療心臟疾病。既往研究表明，電針心經“神門-通里”段能夠治療急性心肌缺血，有效改善心功能，對心臟具有保護作用。

本實驗采用冠狀動脈結扎法制備急性心肌缺血模型，心電圖中ST段明顯升高，表明動物模型復制成功。CK和CK-MB是診斷急性心肌缺血的重要心肌酶指標，兩者同時檢測有助于病情的診斷和分析，且對判斷臨床預后具有一定價值。IMA已經被廣泛應用于心肌缺血的臨床評判依據，是早期診斷心肌缺血的重要標志物。IMA的釋放能夠促進心肌細胞的炎癥反應和氧化應激反應，從而影響病情的發展。本研究結果表明，急性心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB、IMA升高，電針心經“神門-通里”段能夠降低CK和CK-MB的活性和IMA的表達水平，從而起到減輕心肌損傷，保護心功能的作用。

NF-κB能參與機體防御反應、組織損傷和應激反應、細胞分化及凋亡，調控炎癥反應，屬于多種基因表達的調控轉錄因子。NF-κB的表達變化能反映參與炎癥反應中細胞因子的變化，與心肌缺血疾病發生時所產生的氧自由基和心肌組織釋放的炎癥遞質相關，是此病理過程中重要的調節因子，能夠影響心肌缺血的進程。此外，心肌細胞的凋亡也與NF-κB的激活相關。馬駿等研究發現，大鼠心肌缺血后心肌組織中NF-κB蛋白表達水平明顯增加，使NF-κB活化。有研究發現，電針能夠降低血清中炎癥因子水平，進而調控下游炎癥因子，從而下調NF-κB p65蛋白的表達水平。本實驗結果表明，急性心肌缺血后大鼠的NF-κB的活化明顯，電針刺激后，NF-κB蛋白及mRNA表達水平均下降，說明電針能夠抑制其活化從而達到保護心肌的作用。

綜上，電針心經能夠通過逆轉心肌組織NF-κB的表達而改善急性心肌缺血。在治療第3天開始起效，治療第7天時效果最明顯。本研究結果表明，電針時間對急性心肌缺血大鼠心臟損傷具有一定的保護作用；實驗結果表明的最佳時間可能為7 d，但針刺療效是否隨著時間延長而繼續增加，這有待進一步的研究。由于現有的臨床和基礎實驗條件不足，對于針刺時間仍缺少固定的量化標準。因此，在未來的臨床應用中，也應注意針刺時效關系，從而獲得更好的臨床療效。