排膿散湯劑和散劑中有效成分生物利用度的比較研究

李嘉誠(chéng)，張孟孟，芮雪琳，楊 曄,2，徐 莉，江倩倩，尹登科,2,3

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2. 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3. 現(xiàn)代中藥研究與開(kāi)發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

中藥散劑是傳統(tǒng)劑型之一，具有藥材用量少、成本低、制備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。歷代醫(yī)家在使用中藥散劑過(guò)程中積累了大量經(jīng)驗(yàn)，明確指出“宜散不宜湯”的一些方藥，如玉屏風(fēng)散、五苓散、逍遙散。排膿散出自《金匱要略》，由枳實(shí)、白芍、桔梗3味中藥組成，三者比為5∶5∶2，以散劑形式給藥，主治癤、癰、疔、淋巴結(jié)炎和直腸潰瘍等炎癥疾病，臨床上療效確切。目前在實(shí)驗(yàn)研究中多采用排膿散湯劑(水提物)給藥形式，臨床多采用散劑的給藥形式，兩者的有效成分生物利用度的差異尚不清楚。散劑是原始的劑型，存在藥材不宜辨認(rèn)、服藥口感差、藥材粉末表面積大、藥材揮發(fā)性成分易散失等問(wèn)題，在臨床上應(yīng)用逐步減少。宜散不宜湯的科學(xué)內(nèi)涵也沒(méi)有得到完全的闡釋，王建農(nóng)等對(duì)同方湯劑和散劑差異的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，闡明了同方湯劑脂溶性成分丟失是宜散方的主要原因，指出散劑具有不可替代的臨床功效。排膿散主要有效成分有芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等。本研究選擇這4種成分作為排膿散的指標(biāo)性成分，建立分析方法對(duì)排膿散同方湯劑和散劑進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)比較研究，為排膿散劑型選擇提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑 橙皮苷對(duì)照品(批號(hào) DST190716-038，色譜純)、新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào) DST190929-039，色譜純)、柚皮苷對(duì)照品(批號(hào) DST191011-099，色譜純)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào) DST190303-070，色譜純)：樂(lè)美天醫(yī)藥有限公司；內(nèi)標(biāo)梔子苷(批號(hào) BWB50533)：北京北方偉業(yè)計(jì)量研究院；枳實(shí)(批號(hào) 200601)、芍藥(批號(hào) 200320)、桔梗(批號(hào) 200312)：安徽廣河中藥有限公司，均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為正品。甲醇、乙腈：美國(guó)Thermo Scientific；乙酸乙酯：中國(guó)上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器 三重四級(jí)桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀(AB SCIEX QTrap 5500)：美國(guó)AB SCIEX；超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)儀(Thermo Scientific Ultimate 3000 RS )：美國(guó)Thermo Scientific；十萬(wàn)分之一分析天平(EX125DZH)：美國(guó)OHAUS；高速冷凍離心機(jī)(5300XR)：德國(guó)Eppendorf。超純水凈化系統(tǒng)(Mili-Q)：美國(guó)Millipore。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)健康SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2017-0001]提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間大鼠可以自由獲得食物和水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24～26 ℃，濕度為60%～70%。大鼠給藥前需禁食12 h，飲水自由。

2 方法與結(jié)果

2.1 排膿散湯劑與散劑的制備方法 ①排膿散湯劑制備：分別取枳實(shí)50 g、白芍50 g、桔梗20 g，加10倍量水，加熱回流提取2次，每次40 min，過(guò)濾，分離濾渣濾液抽濾，合并水提液，濃縮，使生藥質(zhì)量濃度至3.2 g/mL。4 ℃條件下保存，備用。②排膿散散劑制備：分別取枳實(shí)、白芍、桔梗，用打粉機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，稱量枳實(shí)1.33 g、白芍1.33 g、桔梗0.53 g，混勻，給藥前用生理飲水混懸，使生藥質(zhì)量濃度至3.2 g/mL。

2.2 排膿散體外含量測(cè)定

2.2.1 UPLC條件 色譜柱：Themo Scientific Syncronis C(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)和水(B)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。梯度洗脫：0～3 min，80% B；3～4 min，65% B；4～9 min，65% B；9～13 min，50% B；13～14 min，25% B；14～17.5 min，25% B；17.5～17.6 min，80% B；17.6～22 min，80% B。

2.2.2 樣品前處理方法 按“2.1”項(xiàng)制備排膿散湯劑樣品，稀釋至0.16 g/mL，過(guò)0.45 μm濾膜，備用。散劑樣品用10 mL甲醇(70%)超聲提取30 min，20 ℃下5 000 r/min離心，取上清液，稀釋20倍，過(guò)0.45 μm濾膜，備用。配制芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷與新橙皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，其中芍藥苷濃度為0.006、0.015、0.03、0.06、0.15 mg/mL，橙皮苷濃度為0.008、0.02、0.04、0.08、0.2 mg/mL，柚皮苷濃度為0.04、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL，新橙皮苷濃度為0.084、0.21、0.42、0.84、2.1 mg/mL。

2.2.3 排膿散同方湯劑和散劑有效成分含量 排膿散散劑中，芍藥苷(0.52±0.06)mg/g，柚皮苷(1.31±0.07)mg/g，橙皮苷(0.22±0.04)mg/g，新橙皮苷(1.36±0.12)mg/g。排膿散湯劑中，芍藥苷(0.46±0.08)mg/g，柚皮苷(1.21±0.08)mg/g，橙皮苷(0.16±0.06)mg/g，新橙皮苷(1.49±0.14)mg/g。排膿散散劑和湯劑各成分含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)，

n

=3，

P

>0

.

05)。

2.3 UPLC-MS/MS條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Themo Scientific Syncronis C(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)和水(B)；柱溫：35 ℃。梯度洗脫：0～1 min，75% B；1～2 min，75%～60% B；2～3 min，60% B；3～4 min，45% B；4～6 min，45%～75% B；6～8 min，75% B。運(yùn)行時(shí)間12 min，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 待測(cè)成分質(zhì)譜分析使用美國(guó)AB SCIEX公司Qtrap 5500三重四極桿串聯(lián)線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀，以ESI作為電離源，在負(fù)離子模式下MRM模式對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行分析。ESI為4 500 V，溫度500 ℃。氣簾氣壓241.3 kPa，霧化氣壓344.7 kPa，干燥氣壓344.7 kPa。待測(cè)成分質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

將一定濃度的單一分析物加入U(xiǎn)PLC-MS/MS系統(tǒng)，采用全掃描的模式確定組分的正負(fù)離子，以ESI作為電離源獲得目標(biāo)組分的前體離子，然后在產(chǎn)物離子掃描模式下優(yōu)化碰撞能，得到目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜特征離子圖，最后在MRM模式下進(jìn)一步優(yōu)化碰撞電壓和去簇電壓。為了降低基線、背景噪音，提高分離效果和響應(yīng)值，質(zhì)譜分析采用MRM模式進(jìn)行定量。物質(zhì)一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜特征見(jiàn)圖1、圖2，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)標(biāo)物與各待測(cè)成分的質(zhì)譜條件

圖1 排膿散中芍藥苷(A)、柚皮苷(B)、橙皮苷(C)和新橙皮苷(D)的一級(jí)質(zhì)譜圖

圖2 排膿散中芍藥苷(A)、柚皮苷(B)、橙皮苷(C)和新橙皮苷(D)的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.4 對(duì)照品和儲(chǔ)備液的配制 精密稱取芍藥苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷各10 mg，分別加入1 mL純甲醇，超聲溶解，即得質(zhì)量濃度為10 mg/mL各成分對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；并取適量各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合稀釋為各成分濃度為250 μg/mL，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱量梔子苷對(duì)照品10 mg，加入1 mL甲醇超聲溶解，取適量梔子苷對(duì)照品溶液，以甲醇稀釋成10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.5 血漿樣品的采集 將18只雄性SPF級(jí)SD大鼠[體質(zhì)量(200±20)g]隨機(jī)分為空白組、排膿散散劑組、排膿散湯劑組，每組6只，禁食12 h，期間自由飲水。排膿散散劑組灌胃給予3.2 g/mL排膿散混懸液，排膿散湯劑組灌胃給予3.2 g/mL排膿散水提液，給藥后分別于3、5、10、20、40、60、90 min，2、4、8、12、24、36、48 h用毛細(xì)管從大鼠眼眶取血250 μL，置于肝素鈉采血管中，4 ℃下5 000 r/min離心10 min，將上層血清移入1.5 mL離心管內(nèi)，-20 ℃條件下保存，等待進(jìn)行樣品前處理。

2.6 血漿樣品前處理 大鼠血漿樣品在室溫下解凍后，取100 μL血漿，加入1 000 μL乙酸乙酯，加入5 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混合溶液渦旋10 min。渦旋后樣品放入高速冷凍離心機(jī)中，4 ℃下12 000 r/min離心15 min。將上清液移入1.5 mL離心管中，室溫過(guò)夜，晾干。再加入100 μL甲醇制成100 μL混合溶液，渦旋5 min后，放入高速冷凍離心機(jī)中，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液50 μL，待測(cè)。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性 分別精密吸取100 μL空白血漿，加入芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL；以及給藥后采集的血樣，均按照“2.6”項(xiàng)中血漿樣品前處理方法處理后，按前述UPLC-MS/MS條件進(jìn)樣，記錄所得色譜圖。各成分峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰型良好，而且血漿的內(nèi)源性物質(zhì)不影響待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定，基線平穩(wěn)，且專屬性良好。

2.7.2 線性范圍 精密吸取大鼠空白血漿100 μL，共9份，依次加入10 μL混合對(duì)照品溶液，其中各成分含量均為0.002、0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL。結(jié)果排膿散各主要成分的線性方程如下：

芍藥苷：

A

=0

.

003 83

ρ

+0

.

031 31(

r

=0

.

993 22)；柚皮苷：

A

=0

.

115 61

ρ

+0

.

371 14(

r

=0

.

997 00)；橙皮苷：

A

=0

.

100 59

ρ

+0

.

083 17(

r

=0

.

990 80)；新橙皮苷：

A

=0

.

115 65

ρ

+1

.

588 69(

r

=0

.

992 29)。

結(jié)果顯示，各待測(cè)成分含量在0.2～500 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.7.3 精密度、提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 分別取6份100 μL空白血漿，按照各個(gè)成分的低濃度質(zhì)控樣品、中濃度質(zhì)控樣品、高濃度質(zhì)控樣品的濃度要求配制質(zhì)控樣品，并按照“2.6”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，依照測(cè)量結(jié)果計(jì)算RSD值。

采用100 μL空白血漿，制備3個(gè)不同濃度的質(zhì)控樣品，血漿樣品按照“2.6”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品前處理，分別配制3組樣品。①將空白血漿中加入4種成分的3個(gè)不同濃度的質(zhì)控樣品，進(jìn)行樣品前處理；②對(duì)空白血漿進(jìn)行樣品前處理后，加入4種成分的3個(gè)不同濃度的質(zhì)控樣品；③復(fù)溶溶劑直接溶解的4種成分的3個(gè)不同濃度的質(zhì)控樣品。每個(gè)樣品平行制備6份，經(jīng)分析檢測(cè)后計(jì)算各個(gè)成分的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法精密度較好，RSD<13%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性較好。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該方法提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)均符合生物樣品分析方法的要求。見(jiàn)表2。

表2 待測(cè)成分的精密度、提取回收率

2.7.4 穩(wěn)定性考察 將質(zhì)控血漿樣品在室溫下儲(chǔ)存24 h后，評(píng)價(jià)其室溫穩(wěn)定性；在4 ℃條件下評(píng)價(jià)其短期穩(wěn)定性；在-20 ℃條件下反復(fù)凍融3次，評(píng)價(jià)其凍融穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.2、10、500 ng/mL各待測(cè)成分的短期穩(wěn)定性、室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性均良好，滿足生物樣品分析條件。

2.7.5 數(shù)據(jù)處理分析 采用DAS 2.0軟件分析血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用SPSS 23.0軟件對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。

2.8 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 4種成分的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3，藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。4種待測(cè)成分的擬合曲線評(píng)級(jí)符合二室模型評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，排膿散散劑中橙皮苷的曲線下面積(area under curve, AUC)顯著高于排膿散湯劑。而排膿散散劑中芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷的AUC與湯劑比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0

.

05)。

圖3 排膿散散劑和湯劑中芍藥苷(A)、柚皮苷(B)、橙皮苷(C)和新橙皮苷(D)在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線

表3 排膿散湯劑和散劑有效成分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

排膿散的散劑與湯劑中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，排膿散散劑中橙皮苷的AUC較湯劑更高，說(shuō)明排膿散的散劑有助于橙皮苷的吸收。研究證實(shí)，橙皮苷因其低溶解性，難以透過(guò)腸上皮細(xì)胞，腸胃對(duì)其吸收主要依靠細(xì)胞旁路途徑實(shí)現(xiàn)。散劑顆粒粘附于胃腸道，釋放橙皮苷的劑量與接觸時(shí)間均大于湯劑，因此可導(dǎo)致排膿散散劑在大鼠體內(nèi)的生物利用度高于同方湯劑。

同時(shí)，排膿散湯劑和散劑中芍藥苷、柚皮苷和新橙皮苷的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是這3種成分的水溶性相對(duì)較好。湯劑中藥物含量不低于散劑。劉洋等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥苷主要在空腸部位吸收，柚皮苷和新橙皮苷主要在十二指腸部位吸收。因此，散劑與湯劑對(duì)比，柚皮苷與新橙皮苷的AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。散劑的達(dá)峰濃度較高的主要原因可能是中藥顆粒粘附于十二指腸腸壁釋藥，而湯劑中芍藥苷的達(dá)峰濃度高于散劑，但是其平均滯留時(shí)間小于散劑，盡管差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍可說(shuō)明散劑相對(duì)于湯劑具有一定的緩釋特性。

散劑作為一種傳統(tǒng)的速效劑型，對(duì)于水溶性很好的成分，可實(shí)現(xiàn)快速釋藥；而對(duì)于水溶性稍差的成分，可以提高其生物利用度。橙皮苷具有廣泛的藥理活性，如抗炎、保護(hù)腸上皮、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用。本研究結(jié)果可為排膿散劑型的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。