乳糜微粒流對黃芩苷納米乳動物體內(nèi)組織分布的影響研究

仇靜文，鄭轉(zhuǎn)弟，鐘 華，吳鴻飛

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

黃芩是記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》的傳統(tǒng)藥材之一，在中國應(yīng)用歷史悠久。黃芩苷作為黃芩的主要藥用成分，藥理作用廣泛，在臨床治療急、慢性肝炎中發(fā)揮著重要作用。乙型肝炎病毒容易通過淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)在淋巴系統(tǒng)中蓄積，形成肝外的病毒儲存庫，由于淋巴系統(tǒng)結(jié)構(gòu)特殊，黃芩苷常規(guī)劑型只可清除血液中的病毒，使肝炎患者血液指標(biāo)達(dá)到正常，無法根本清除藏匿于體內(nèi)淋巴系統(tǒng)中的病毒，從而導(dǎo)致大多數(shù)患者難以痊愈。

納米乳是由油、水兩種不混溶的液體，在適當(dāng)輔料穩(wěn)定下自發(fā)形成的分散系統(tǒng)，熱力學(xué)、動力學(xué)穩(wěn)定，在長期儲存過程中沒有任何明顯的絮凝或聚結(jié)。納米乳具有比表面積大、粒徑小和親脂性組分比例大的特點(diǎn)。納米乳制劑被吸收消化形成乳滴后，會與分泌腸上皮細(xì)胞脂蛋白特別是乳糜微粒結(jié)合，組裝形成囊泡，最終進(jìn)入淋巴循環(huán)系統(tǒng)。因此，納米乳作為新型淋巴靶向給藥載體受到愈來愈多的關(guān)注。

筆者所在課題組一直致力于構(gòu)建難溶性藥物油基納米制劑，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此納米乳體系可增加藥物經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高藥物吸收，但納米乳是否通過乳糜微粒的介導(dǎo)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以油包水(W/O)型黃芩苷納米乳為研究對象，建立乳糜微粒流阻斷模型，考察乳糜微粒介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是否會對黃芩苷納米乳在大鼠體內(nèi)的淋巴靶向性產(chǎn)生影響，初步闡明黃芩苷納米乳具有淋巴靶向性的機(jī)制，以期為黃芩苷納米乳的臨床應(yīng)用、淋巴靶向制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫液相色譜儀(1260 Infinity型)：美國Agilent科技有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)(Allegra 64R型)：美國Beckmancoulter有限公司；高速分散均質(zhì)機(jī)(FJ-200型)：上海標(biāo)本模型廠；電子分析天平(FA 2104B 型)：德國Sartorius集團(tuán)。

1.2 藥品與試劑 黃芩苷對照品(批號 110715-301218，含量≥98%)：中國食品藥品檢定研究所；黃芩苷原料藥(批號 141201，含量≥85%)：四川省玉鑫藥業(yè)有限公司；大豆磷脂：沃森生物；蘆丁內(nèi)標(biāo)：國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)管理中心；肉豆蔻酸異丙酯：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)己酰亞胺(cycloheximide，CHM)：奧默生物技術(shù)有限公司；所用試劑均為色譜純。

1.3 動物 SD大鼠120只，體質(zhì)量為230～270 g，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-001。所有實(shí)驗(yàn)動物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理與實(shí)驗(yàn)過程，遵循安徽中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)與使用規(guī)范。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Topsil C(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流動相：甲醇-水(含0.1%磷酸，比例：47∶53)，等度洗脫；紫外檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 生物樣品處理 稱取適量大鼠組織樣品，加入3倍量甲醇制得組織勻漿液。取200 μL組織勻漿液，加入等量磷酸二氫鉀，蘆丁內(nèi)標(biāo)(7.05 μg/mL)混勻，再加入200 μL甲醇和400 μL乙腈去除蛋白，渦旋混勻，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，移取上清液，水浴氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?00 μL流動相復(fù)溶，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取20 μL上清進(jìn)樣分析。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 取大鼠空白組織樣品、黃芩苷對照品加空白組織樣品和給藥后組織樣品，在“2.1項(xiàng)”色譜條件下分析，考察方法專屬性。以大鼠肝組織為例，蘆丁內(nèi)標(biāo)和黃芩苷分別于7.59、14.41 min處出現(xiàn)吸收峰(見圖1)，蘆丁內(nèi)標(biāo)與黃芩苷分離度高，峰形好，同法考察其他組織的專屬性，各組織中黃芩苷濃度的測定未受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

注：A1.肝組織；A2.空白加藥肝組織；A3.空白肝組織

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 稱量5.0 mg黃芩苷對照品，加甲醇精密制備濃度為50.0 μg/mL的對照品儲備液，吸取儲備液用甲醇進(jìn)一步稀釋，配制成濃度依次為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的系列對照品溶液備用。分別精密吸取200 μL大鼠的空白組織勻漿液，依次加入200 μL蘆丁內(nèi)標(biāo)和100 μL的系列黃芩苷對照品溶液，制備成濃度依次為5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/mL的黃芩苷對照品加組織樣品，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，以黃芩苷與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為橫坐標(biāo)(

X

)，相應(yīng)濃度為縱坐標(biāo)(

Y

)進(jìn)行加權(quán)回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，大鼠淋巴組織器官中黃芩苷在0.05～5.0 μg/L濃度范圍內(nèi)回歸系數(shù)(

r

)均大于0.999 7，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 大鼠淋巴組織器官標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 精密度 取低、中、高(0.05、0.5、5 μg/mL)3個濃度的加藥空白組織樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測定，1 d內(nèi)測5次，連續(xù)測3 d，計算批間與批內(nèi)精密度。結(jié)果表明，在該色譜條件下，測得大鼠各淋巴組織器官的批內(nèi)、批間精密度RSD均小于7.0%，表明儀器精密度高，符合要求。

2.3.4 提取回收率 取低、中、高(0.05、0.5、5 μg/mL)3個濃度的加藥空白組織樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積(

A

)，同時記錄該色譜條件下相同濃度的黃芩苷對照品加蘆丁內(nèi)標(biāo)溶液的峰面積(

A

)，提取回收率=

A

/A

×100%。結(jié)果表明，在該色譜條件下，測得大鼠各組織中黃芩苷提取回收率在93.85%～97.38%，RSD低于6%，表明該方法提取回收率高。

2.3.5 穩(wěn)定性 取低、中、高(0.05、0.5、5 μg/mL)3個濃度的加藥空白組織樣品溶液，室溫放置24 h，-20 ℃凍存14 d，經(jīng)3個凍融循環(huán)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，考察該方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在上述條件下，大鼠的RSD均小于6%，表明組織樣品在上述處理中穩(wěn)定性良好。

2.4 乳糜微粒流對大鼠組織藥物分布的影響

2.4.1 黃芩苷納米乳和混懸劑的制備 參照本課題組前期的研究，稱取313.5 mg黃芩苷原料藥，加入10.5 g丙二醇、10.5 g大豆磷脂和9.0 g丙酯的混合溶液中，恒溫水浴攪拌至完全溶解，再逐滴加入3.0 g雙蒸水磁力攪拌，最終制得淡黃色透明液體[載藥量：9.5 mg/mL；平均粒徑：(63.40±1.1) nm]。稱取181.0 mg黃芩苷原料藥加入20 mL雙蒸水中，混勻即得黃芩苷混懸劑。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)采用大鼠腹腔注射環(huán)己酰亞胺復(fù)制經(jīng)典的大鼠乳糜微粒阻斷模型。將雄性大鼠隨機(jī)分為4組，分別為黃芩苷混懸劑阻斷組、黃芩苷混懸劑未阻斷組、黃芩苷納米乳阻斷組和黃芩苷納米乳未阻斷組。給藥前禁食12 h。黃芩苷混懸劑阻斷和黃芩苷納米乳阻斷組大鼠灌胃給予環(huán)己酰亞胺(3 mg/kg)；黃芩苷混懸劑未阻斷和黃芩苷納米乳未阻斷組大鼠灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液，并于1 h后，分別灌胃給藥黃芩苷混懸劑和黃芩苷納米乳(144.0 mg/ kg，按照動物體表面積換算)。

2.4.3 生物樣品的采集 各組大鼠(

n

=3)于灌胃0.5、1、2、4、6、8、10、12、18、24 h后斷頭處死，收集各組織，0.9%氯化鈉水溶液將各組織洗凈，吸干，精密稱質(zhì)量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件和“2.2”項(xiàng)下方法測定各組織中黃芩苷濃度。

2.4.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析 采用DAS 2.0程序處理大鼠各淋巴組織器官的黃芩苷濃度-時間數(shù)據(jù)，獲得藥物代謝動力學(xué)參數(shù)；采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

(1)阻斷組及未阻斷各組大鼠組織的血藥濃度-時間曲線 黃芩苷混懸劑阻斷組和未阻斷組大鼠的體內(nèi)組織分布情況相似，而黃芩苷納米乳阻斷組和未阻斷組大鼠的體內(nèi)組織分布特性存在顯著性差異；與黃芩苷納米乳未阻斷組相比，納米乳阻斷組大鼠的血藥濃度-時間曲線下面積和藥峰濃度在脾、胸腺、淋巴中增大，肝中減小，該結(jié)果表明乳糜微粒介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能會對黃芩苷納米乳在淋巴組織中的分布產(chǎn)生影響，含黃芩苷的納米乳制劑可能是通過乳糜微粒介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)被機(jī)體吸收。見圖2。

注：A.肝；B.脾；C.胸腺；D.淋巴

(2)黃芩苷濃度-時間數(shù)據(jù)分析及主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù) 由表2、表3、圖3可知，與納米乳藥物代謝動力學(xué)阻斷組相比，納米乳藥物代謝動力學(xué)未阻斷組大鼠淋巴、胸腺和脾

c

提高了1.2倍以上，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0

.

05)；大鼠脾、胸腺和淋巴結(jié)AUC顯著增加(

P

<0

.

05)；大鼠肝、胸腺和淋巴結(jié)MRT明顯增加(

P

<0

.

05)；與納米乳組結(jié)果相反，混懸劑阻斷組和未阻斷組在淋巴組織器官和肝組織中的藥物動力學(xué)參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0

.

05)；表明乳糜微粒介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可以提高黃芩苷納米乳在胸腺、淋巴結(jié)中的分布，使藥物在淋巴組織的停留時間增加，對黃芩苷混懸劑在組織中的分布沒有影響。

表2 黃芩苷納米乳藥物代謝動力學(xué)阻斷組、未阻斷組在各組織中的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)

表3 黃芩苷混懸劑乳糜微粒阻斷組、未阻斷組在各組織中藥物代謝動力學(xué)參數(shù)

注:與黃芩苷納米乳阻斷組比較,*P<0.05圖3 乳糜微粒途徑對黃芩苷納米乳組織(A)、黃芩苷混懸劑組織(B)分布的影響

3 討論

黃芩苷體內(nèi)吸收代謝局限、口服生物利用低，前期研究證實(shí)，黃芩苷納米乳口服生物利用度是混懸制劑的14.56倍，淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)量可達(dá)26.8%，但納米乳是否通過乳糜微粒的介導(dǎo)尚不清楚。

本研究建立淋巴阻斷動物模型，考察乳糜微粒流對納米給藥系統(tǒng)體內(nèi)分布的影響。淋巴阻斷動物模型主要包括動物淋巴插管模型和乳糜微粒阻斷模型，動物淋巴管插管模型是通過插管收集動物淋巴液，測定藥物含量，計算藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)量，但此方法由于乳糜池與胸導(dǎo)管位置較深，并且周圍存在大量的血管，所需手術(shù)技術(shù)復(fù)雜，成功率較低，而乳糜微粒阻斷模型由于操作步驟簡便、成功率高，已被醫(yī)藥工作者應(yīng)用于藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，且研究證實(shí)該模型與淋巴管插管動物模型具有很高的相關(guān)性。

乳糜微粒阻斷模型的構(gòu)建是通過給大鼠灌胃給予一定量的環(huán)己酰亞胺，抑制大鼠體內(nèi)乳糜微粒的分泌，從而最終阻斷藥物進(jìn)入淋巴系統(tǒng)。大鼠注射環(huán)己酰亞胺后，顯著影響黃芩苷納米乳在大鼠淋巴組織器官的AUC、

c

等藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，表明乳糜微粒介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有利于黃芩苷納米乳在淋巴組織器官中的吸收和分布。此納米給藥系統(tǒng)以脂質(zhì)大豆油為基質(zhì)，藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)的淋巴生化過程需要一定量的脂質(zhì)，脂質(zhì)在一定程度上輔助了藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)。乳糜微粒在納米乳的刺激下分泌增多，從而增加黃芩苷經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)總量，從而使藥物在體內(nèi)淋巴組織器官內(nèi)富集，這可能是黃芩苷納米乳具有淋巴靶向性的原因，但具體機(jī)制有待更深入的探索。