黃連調控miR-26a-3p對急性胰腺炎胰腺細胞增殖和凋亡的影響

曾小華 廖輝軍 劉柏京 樂冬友

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種以胰腺局部炎癥和全身炎性反應為特征的急性炎癥性疾病，根據(jù)嚴重程度的不同，可將AP分為輕癥、中癥和重癥AP[1]。輕癥AP最為常見，預后較佳，但是重癥AP病情多變，常伴有胰腺組織壞死及臟器功能衰竭，嚴重時可致死[2]。AP的發(fā)生發(fā)展過程復雜，涉及多個階段和多種基因的調控。研究表明，胰腺腺泡細胞的增殖和凋亡與AP的嚴重程度密切相關[3]。目前，AP缺乏有效的治療手段。因此，探究影響胰腺腺泡細胞增殖和凋亡的分子機制并尋找有效的治療方法具有重要意義。黃連是常用中藥，味甘性寒，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種功效[4]，但黃連對胰腺腺泡細胞增殖和凋亡的影響及分子機制還未見相關報道。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼RNA，參與炎性和免疫疾病、腫瘤、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5-7]。研究顯示，miR-26-3p在重癥AP中患者血漿中表達降低[8]，但其對胰腺腺泡細胞增殖和凋亡的影響也還未知。本研究利用雨蛙素作用AR42J細胞建立AP細胞模型，探討了黃連提取物對雨蛙素誘導的胰腺腺泡細胞增殖和凋亡的影響及其能否通過調控miR-26-3p表達發(fā)揮作用，以期為AP的治療及分子機制的闡明提供一定的新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與實驗試劑 大鼠胰腺腺泡AR42J細胞細胞(中國科學院上海細胞庫)，黃連飲片(合肥樂家鋪中藥飲片有限公司)，雨蛙素、四甲基噻唑藍(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)和RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hycolne公司)，LipofectamineTM 2000試劑盒和Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，兔抗大鼠P21、半胱天冬酶-3(Caspases-3)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗大鼠髓系細胞觸發(fā)受體1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1，TREM1)單克隆抗體(武漢博士德生物技術有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃連水提物制備：參照文獻方法[9]制備黃連水提物。黃連飲片干燥后稱重，粉碎后，加5倍體積蒸餾水浸泡1 h，水浴2 h，離心。濾渣再加3倍體積蒸餾水，水浴提取1 h，離心。將2次濾液合并，減壓濃縮后冷凍干燥。凍干粉溶于滅菌的去離子水中，0.22 μm過濾，配置1 g/ml的母液，使用時培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染：復蘇AR42J細胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2天更換1次培養(yǎng)基。當細胞融合至80%～90%時，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞后，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，傳代培養(yǎng)。以每孔1×105個AR42J細胞接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，更換無血清培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM 2000試劑盒操作說明，將miR-26a-3p 模擬物mimcs(miR-26a-3p組)及陰性對照序列(miR-NC組)、miR-26a-3p抑制劑(anti-miR-26a-3p組)及陰性對照序列(anti-miR-NC組)TREM1過表達載體(pcDNA3.0-TREM1組)及陰性對照序列(pcDNA3.1組)分別轉染至AR42J細胞。轉染24 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組：①未轉染的AR42J細胞分為對照組：正常培養(yǎng)；雨蛙素組：含10-8 mol/L[10]雨蛙素的培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h；雨蛙素+黃連-L組：含10-8mol/L雨蛙素與2.5 mg/ml[9]黃連的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)8 h；雨蛙素+黃連-M組：含10-8mol/L雨蛙素與5.0 mg/ml黃連的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)8 h；雨蛙素+黃連-H組：含10-8mol/L雨蛙素與10.0 mg/ml黃連的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)8 h。②miR-26a-3p組、miR-NC組AR42J細胞均采用含10-8mol/L雨蛙素的培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，分別記為雨蛙素+miR-26a-3p組、雨蛙素+miR-NC組。③anti-miR-26a-3p組、anti-miR-NC組、pcDNA3.1-TREM1組、pcDNA3.1組AR42J細胞均采用含10-8mol/L雨蛙素與100 mg/ml黃連的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)8 h，分別記為雨蛙素+黃連-H+anti-miR-26a-3p組、雨蛙素+黃連-H+aanti-miR-NC組、雨蛙素+黃連-H+pcDNA3.1-TREM1組、雨蛙素+黃連-H+pcDNA3.1組。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α水平：AR42J細胞以每孔2.5×104個接種于24孔板中。細胞貼壁后，按照1.2.3分組處理。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)上清液。3 500 r/min離心5 min，分別參照IL-6和TNF-α試劑盒說明書檢測上清中IL-6和TNF-α水平。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖：AR42J細胞以每孔5×103個接種于96孔板中。細胞貼壁后，按照1.2.3分組處理。培養(yǎng)結束后，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，于酶標儀490 nm處測定吸光度值(absorbance，A)。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡：AR42J細胞以每孔2.5×104個接種于24孔板中。細胞貼壁后，按照1.2.3分組處理。培養(yǎng)結束后，吸棄培養(yǎng)基，加入適量預冷的PBS清洗細胞，吸棄PBS。加入胰蛋白酶消化，收集細胞。取1.0×106個細胞，加入400 μl結合緩沖液，輕輕吹打混懸細胞后，加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。然后加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μl結合緩沖液，渦旋混勻后上流式細胞儀檢測。

1.2.7 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測細胞中miR-26a-3p和TREM1 mRNA表達水平：收集各組細胞，PBS清洗后，加入Trizol試劑提取細胞中總RNA。微量核酸儀檢測RNA的濃度進行定量后，參照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，行PCR擴增。擴增條件：95℃10 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共進行35個循環(huán)。引物序列：miR-26a-3p上游5’-GTAGCGCGATGCCGAACGTG-3’，下游5’-GCGTGAACGGCCGTGACG-3’；TREM1上游5’-CGTGTGAAACGCTGCAGAGC-3’；下游5’-CAGGCTGCGTGAAGAACGT-3’；U6上游5’-GAACGTGCCGGGCGTGCAG-3’，下游5’-GGTGAACGCCGTGGACGCC-3’；GAPDH上游5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游5’-TCCACCACCCTGT TGCTGTA-3’。miR-26a-3p以U6為內參，TREM1以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算miR-26a-3p和TREM1 mRNA的相對表達水平。

1.2.8 蛋白印跡(Western Blot)法檢測細胞中P21、Caspases-3和TREM1蛋白表達水平：收集各組細胞，PBS清洗后，加入RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度對蛋白定量后，取適量蛋白溶液，100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔蛋白上樣量30 μg。電泳后，濕轉至聚偏乙烯二氟膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h。分別加入P21(稀釋比1∶600)、Caspases-3(稀釋比1∶400)、TREM1(稀釋比1∶400)抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗(稀釋比1∶200)，37℃孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-26a-3p和TREM1靶向關系：生物信息學軟件預測顯示，TREM1的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)存在與miR-26a-3p結合的核苷酸序列。PCR擴增含miR-26a-3p結合位點的TREM1的3’UTR序列，構建TREM1野生型質粒(WT-TREM1)。并利用基因定點突變技術將結合位點突變，構建TREM1突變型質粒(MUT-TREM1)。AR42J細胞接種于6孔板中，融合至60%時，分別共轉染TREM1-WT、TREM1-MUT與miR-26a-3p mimic、陰性對照。轉染24 h后，收集細胞，檢測各組熒光素酶活性。具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，結果以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示。

2 結果

2.1 黃連提取物對AP細胞中IL-6和TNF-α表達的影響 與對照組比較，雨蛙素組AR42J細胞IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。與雨蛙素組比較，雨蛙素+黃連-L組、雨蛙素+黃連-M組和雨蛙素+黃連-H組AR42J細胞IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 黃連提取物對AP細胞中miR-26a-3p、IL-6、TNF-α表達的影響

2.2 黃連提取物對AP細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，雨蛙素組AR42J細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。與雨蛙素組比較，雨蛙素+黃連-L組、雨蛙素+黃連-M組和雨蛙素+黃連-H組AR42J細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。見表2，圖1、2。

表2 黃連提取物對AP細胞增殖、凋亡的影響

圖1 黃連提取物對AP細胞凋亡的影響

圖2 黃連提取物對急性胰腺炎細胞增殖、凋亡蛋白表達的影響

2.3 黃連提取物對急性胰腺炎細胞miR-26a-3p表達的影響 與對照組比較，雨蛙素組AR42J細胞miR-26a-3p水平降低(P<0.05)。與雨蛙素組比較，雨蛙素+黃連-L組、雨蛙素+黃連-M組和雨蛙素+黃連-H組AR42J細胞miR-26a-3p水平升高(P<0.05)。見表3。

2.4 過表達miR-26a-3p對急性胰腺炎細胞增殖、凋亡及IL-6和TNF-α表達的影響 與雨蛙素+miR-NC組比較，雨蛙素+miR-26a-3p組AR42J細胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。見圖3、4，表3。

圖3 過表達miR-26a-3p對急性胰腺炎細胞凋亡的影響

圖4 過表達miR-26a-3p對急性胰腺炎細胞增殖凋亡蛋白表達的影響

表3 過表達miR-26a-3p對急性胰腺炎細胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表達的影響

2.5 抑制miR-26a-3p能逆轉黃連提取物對AP細胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表達的影響 與雨蛙素+黃連-H+anti-miR-NC組比較，雨蛙素+黃連-H+anti-miR-26a-3p組AR42J細胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。見圖5、6,表4。

表4 抑制miR-26a-3p能逆轉黃連提取物對AP細胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表達的影響

圖5 抑制miR-26a-3p能逆轉黃連提取物對急性胰腺炎細胞凋亡的影響

2.6 miR-26a-3p靶向調控TREM1的表達 生物信息學軟件預測顯示，TREM1的3’UTR存在與miR-26a-3p結合的連續(xù)位點。與miR-NC組比較，miR-26a-3p組共轉染W(wǎng)T-TREM1的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而共轉染MUT-TREM1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。miR-26a-3p組TREM1 mRNA水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-26a-3p組TREM1 mRNA水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。這說明miR-26a-3p靶向負調控TREM1的表達。見圖7，表5、6。

圖6 抑制miR-26a-3p能逆轉黃連提取物對急性胰腺炎細胞增殖凋亡蛋白表達的影響

圖7 miR-26a-3p靶向TREM1

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 miR-26a-3p調控TREM1的表達

2.7 過表達TREM1能逆轉黃連提取物對急性胰腺炎細胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表達的影響 與雨蛙素+黃連-H+pcDNA3.1組比較，雨蛙素+黃連-H+pcDNA3.1-TREM1組AR42J細胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率、P21、Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。見圖8、9,表7。

圖8 過表達TREM1能逆轉黃連提取物對急性胰腺炎細胞凋亡的影響

圖9 過表達TREM1能逆轉黃連提取物對急性胰腺炎細胞增殖凋亡蛋白表達的影響

表7 過表達TREM1能逆轉黃連提取物對AP細胞增殖凋亡及IL-6、TNF-α表達的影響

3 討論

AR42J細胞來自于大鼠胰腺腺泡細胞瘤，由于其易培養(yǎng)、刺激反應大且轉染效率高，常用于AP細胞模型的建立[11]。雨蛙素是一種生物活性多肽，可刺激膽囊收縮及胰酶分泌，促進胰腺腺泡細胞凋亡，損傷組織[12]。本研究顯示，雨蛙素處理后，AR42J細胞IL-6和TNF-α分泌水平明顯增加，提示模型建立成功。

田立群等[13]研究顯示，黃連降脂合劑可抑制動脈粥樣硬化(AS)大鼠血管組織細胞間黏附分子-1和核因子-κB的表達，改善AS大鼠血脂水平，發(fā)揮抗AS作用。韓春楊等[9]研究顯示，黃連水提液可抑制脂多糖誘導的大鼠肝細胞凋亡，減少IL-6和TNF-α等炎性因子的釋放，保護肝損傷。本研究顯示，黃連提取物可降低雨蛙素誘導的AR42J細胞IL-6和TNF-α分泌，提示黃連提取物可通過降低炎性反應保護胰腺腺泡細胞損傷。細胞的增殖和凋亡在AP發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究顯示，雨蛙素可降低AR42J細胞活性，并誘導AR42J細胞凋亡，而黃連提取物可抑制受損的AR42J細胞增殖，促進受損的AR42J細胞凋亡。P21是一種細胞生長抑制因子，其表達升高可抑制細胞增殖[14]。Caspase-3是caspase級聯(lián)反應的關鍵調控蛋白，參與細胞凋亡，是細胞凋亡執(zhí)行蛋白[15]。本研究顯示，黃連提取物可促進雨蛙素誘導的AR42J細胞P21和Caspase-3蛋白表達，提示黃連提取物通過調控P21和Caspase-3蛋白表達影響雨蛙素誘導的AR42J細胞增殖和凋亡。

AP的發(fā)生發(fā)展受到miRNA的調控。如王曉華等[16]研究顯示，miR-181a-5p表達通過靶向上調PIAS1表達降低TNF-α和IL-6表達及細胞凋亡，參與AP的發(fā)病過程。目前研究表明，miR-26-3p在重癥急性胰腺炎中患者血漿中表達降低，但其對胰腺腺泡細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究顯示，雨蛙素可降低AR42J細胞中miR-26-3p表達水平，而黃連提取物可提高雨蛙素誘導的AR42J細胞中miR-26-3p表達，提示miR-26-3p參與AP發(fā)生發(fā)展，且黃連提取物可能通過調控miR-26-3p表達影響AR42J細胞的增殖和凋亡。通過轉染miR-26-3p mimics至AR42J細胞，結果顯示，過表達miR-26-3p可抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞增殖，并促進細胞凋亡，而抑制miR-26-3p表達降低了黃連提取物對雨蛙素誘導的AR42J細胞增殖和凋亡及炎性因子IL-6和TNF-α的分泌，進一步說明了黃連提取物通過上調細胞中miR-26-3p表達影響雨蛙素誘導的AR42J細胞增殖、凋亡和炎性反應。

雙熒光素酶活性及RT-qPCR檢測證實了miR-26-3p在AR42J細胞中靶向負調控TREM1表達。TREM1屬于免疫球蛋白超家族受體，介導炎性反應，可促進單核細胞、巨噬細胞中TNF-α和IL-1的表達[17]。研究顯示，重癥AP大鼠胰腺組織TREM-1表達顯著增加，且和疾病嚴重程度相關，TREM-1在重癥AP發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[18]。本研究顯示，過表達TREM1后，黃連提取物對雨蛙素誘導的AR42J細胞增殖、凋亡和炎性因子IL-6和TNF-α分泌的影響降低，進一步表明黃連提取物通過上調miR-26-3p表達，進而下調TREM1表達抑制受損的AR42J細胞，并促進受損細胞凋亡，且降低炎性反應。

綜上所述，黃連提取物可抑制受損的AR42J細胞增殖和炎性反應，并促進受損的細胞凋亡，其可能通過上調細胞中miR-26-3p表達，進而下調TREM1表達發(fā)揮作用。但本研究尚存在不足之處，僅在細胞層面進行了初步探討，接下來將通過魔物模型實驗進一步深入探討黃連提取物對AP的治療作用及作用機制。