miR-199a通過NF-κB通路抑制子宮內膜干細胞黏附和侵襲的機制研究

楊愛仲 梁程程 胡天祺 楊紅

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是育齡期女性常見病，發病率10%～15%，在不孕及慢性盆腔痛女性中，發病率更高達40%～50%[1]。當前對EMs的治療主要采取手術和激素類藥物治療，然而，無論何種治療，2年復發率為21.5%，5年復發率在40%～50%[2]。因此，進一步研究闡明EMs發生發展的病理機制，尋求確實安全、有效的防治其復發的方法，成為當前EMs研究的首要任務。子宮內膜干細胞(endometrial stem cells，EnSCs)是子宮內膜中具有自我更新、無限增殖及多向分化能力的成體干細胞[3]。自2004年首次被分離鑒定至今，越來越多的研究證實EnSCs在EMs的發生發展和復發中具有關鍵性的作用[4]。研究證實，EnSCs較子宮內膜細胞具有更強的黏附、侵襲及血管生成能力，隨逆流的經血到達腹腔后，突破腹水、腹腔細胞和腹膜細胞外基質3道防線，在“異地”生長，從而形成內異灶[5,6]。與在位EnSCs相比，異位EnSCs顯示出進一步增強的侵襲和血管生成能力[7,8]。此外，與子宮內膜細胞不同，EnSCs不表達雌激素受體[9]。因此，探明影響EnSCs增殖和侵襲能力的機制成為近年EMs預防和治療的研究熱點。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度19～25個核苷酸的非編碼RNA分子，可通過轉錄后沉默或刺激轉錄物降解來調節基因表達[10]。研究顯示，與對照組相比，EMs患者的腹腔液、血漿、子宮內膜及內異病灶中存在多種miRNA水平的下降，且miRNA水平與VEGF-A等血管生成因子負相關[11-13]。miRNA通過抑制子宮內膜基質細胞或子宮內膜干細胞的增殖，促進孕激素抵抗或氧化應激等途徑，抑制EMs的進程[14,15]。miR-199a是較早發現的人類miRNA之一。研究發現，與健康者受試者相比，EMs患者在位子宮內膜、卵巢內膜囊腫及血清miR-199a的表達均降低，且EMs患者異位子宮內膜組織的miR-199a表達較在位子宮內膜進一步降低[16,17]，這一變化與EnSCs黏附侵襲能力的改變相一致。Hsu等[17]在動物模型中發現miR-199a-5p可以減少子宮內膜異位病灶的大小，體外實驗中miR-199a-5p的上調抑制了EnSCs的增殖、運動和血管生成，進一步證實了miR-199a的降低增加了EnSCs的黏附侵襲能力，在EMs的發生發展、復發轉移中發揮了關鍵的作用。本研究進一步探討miR-199a對EnSCs黏附和侵襲的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 胎牛血清(GIBCO,10270-106)，DMEM/F12培養基(GIBCO BRL)，青霉素、鏈霉素(Sigma-Aldrich)，0.25%胰酶(上海康朗)，EDTA (Thermo Fisher Scientific)，2×SYBR Green Mix(南京諾唯贊，北京國藥)，RIPA強裂解液(碧云天)，6× loading buffer(TransGen Biotech)，Trizol(Invitrogen)，Prime Script TM Master Mix(Takara,RR036A)，EnSCs、Oct-4抗體、Nanog抗體、SOX2抗體(Abcam)，miR-199a抑制劑(上海吉瑪)，siRNA(si-p65)(上海吉瑪)，原代子宮內膜干細胞(杭州易文賽)；超凈工作臺(蘇州凈化)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf)，紫外光度儀(日本SHIMADZU)，移液器、實時熒光定量PCR儀(德國Eppendorf)、Western blot裝置(美國Bio-Rad)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代細胞培養:將細胞懸液轉移至DMEM/F12培養基中(含10%胎牛血清和1%雙抗)，置于37℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養。倒置顯微鏡下觀察細胞形態和生長狀態，待細胞融合達到80%～90%時，用0.25%胰酶-0.1EDTA消化液消化，1∶2傳代，實驗時取第3代細胞。

1.2.2 實時熒光定量PCR:Trizol法提取細胞總RNA后進行逆轉錄反應，反應條件為37℃，15 min，85℃，5 s，4℃，10 min。按免疫熒光定量試劑盒進行定量，反應條件為反應條件：95℃，5 min變性；95℃，5 s；60℃，31 s，40次循環。

1.2.3 Western blot:RIPA裂解液裂解細胞，BCA法進行蛋白質定量，加入上樣緩沖液后，98℃水浴鍋煮沸5～10 min，室溫冷卻后-80℃冰箱分裝備用。12% SDS聚丙烯酰胺凝膠，60 V恒壓60 min，120 V恒壓60～90 min分離蛋白，220 mA恒流60～90 min轉移至PVDF膜，放入5% BSA中37℃封閉1 h。4℃孵育搖床(80～100 r/min)過夜孵一抗，TBS-T洗膜3次，15 min/次，37℃恒溫搖床(80～100 r/min)振蕩1 h孵二抗，TBS-T 洗3次，每次10 min，ECL顯影，條帶用軟件Image J分析處理。

1.2.4 siRNA敲除NF-κB p65亞基表達:siRNA sense5’-ACUUUUUUGAAUUUCUGUCAC-3’，anti-sense5’-GACAGAAAUUCAAAAAAGUGG-3’。當培養皿中的原代EnSCs融合達80%時，胰酶消化后將其接種于24孔板中。24 h后將培養基置換Opti-MEM 無血清培養基。按試劑盒說明書，將siRNA配置成濃度20 μmol/L的儲備液，分別取5 μl siRNA和5 μl TransLipid HL加入各250 μl Opti-MEM 無血清培養基中，靜置5 min，將二者輕柔混合，室溫靜置20 min后，取混合液加入24孔板中。置培養箱中培養6 h后將培養基更換為完全培養基，繼續培養24、48 h，收集細胞。

2 結果

2.1 子宮內膜干細胞鑒定 細胞傳代后，經10d培養，鏡下見EnSCs呈纖維樣細胞形態，中間寬，兩端尖，細胞排列無極性。RT-PCR鑒定EnSCs相關標志物Oct4、Sox2、Nanog、Musashi-1、C-Kit陽性。western blot鑒定Oct4、Sox2、Nanog蛋白表達陽性。見圖1～3。

100倍鏡下200倍鏡下

圖2 EnSCs相關標志物的RT-PCR鑒定;M DNA marker;1 Oct4;2 Sox2;3 Nanog;4 Musashi-1;5 C-Kit圖3 EnSCs相關標志物的western blot鑒定

2.2 miR-199a負性調控NF-κB的表達 用miR-199a抑制劑或陰性對照處理EnSCs，48 h檢測蛋白表達， 發現NF-κB通路IKKβ、NF-κBp65的蛋白水平均上調，pIκB-α的水平也上調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表1。

表1 2組EnSCs中NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量

圖4 在EnSCs中，分別轉染miR-199a抑制劑(miR-199a inhibitor)或陰性對照(negative control,N.C)后蛋白水平

2.3 NF-κB對侵襲相關分子的調控 分別用NF-kBp65特異性siRNA(si-p65)或siRNA-NC轉染細胞，48小時后檢測，E-cadherin與TIMP-1的mRNA和蛋白表達均上調，而MMP2與MMP9的mRNA和蛋白表達均下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5，表2、3。

圖5 在EnSCs中，分別轉染NF-κBp65特異性siRNA(si-p65)或陰性對照后侵襲相關分子mRNA水平

表2 2組EnSCs中相關侵襲因子蛋白相對表達量

表3 2組EnSCs中相關侵襲因子mRNA相對表達量

3 討論

miR-199a前體由人類1號染色體(Chr1)和19號染色體(Chr19)上的內含子區域合成，其表達主要受兩種機制調節：Chr1的轉錄因子TWIST1和EGR1、Chr1和Chr19上miR-199a啟動子的甲基化狀態。隨后，miR-199a前體經過進一步加工后以MiR-199a-5p和MiR-199a-3p兩種成熟形式發揮作用[18]。miR-199a在不同組織中的表達模式和功能具有多樣性。Li等[19]發現miR-199a-5p在小鼠和人類非小細胞肺癌中下調，miR-199a-5p通過靶向MAP3K11基因，抑制非小細胞肺癌細胞增殖，使細胞周期停滯在G1期，具有抗腫瘤作用。Qu等[20]則發現miR-199a-5p在宮頸癌患者組織和細胞中上調，miR-199a-5p，miR-199a-5p靶向調節PIAS3表達，促進宮頸癌的細胞增殖和轉移。導致miR-199a這種功能差異的原因可能是在不同組織和細胞中下游靶標的不同。在侵襲方面，研究發現miR-199a通過靶向Integrin 3、HIF-1α、NF-κB等諸多途徑抑制細胞黏附和侵襲[21,22]。Dai等[16]發現miR-199a通過抑制IKKβ/NF-κB通路和減少IL-8表達抑制子宮內膜基質細胞的侵襲。

靜息狀態下，NF-κB與IκB家族結合，以無活性的形式存在于細胞質中。刺激物通過介導IκB激酶(IKK)對IκB的磷酸化，使IκB泛素化降解。NF-κB隨后轉移到細胞核上，通過與啟動子中的靶序列結合激活靶基因的轉錄，從而參與炎癥、免疫、細胞增殖和細胞凋亡等多種生理、病理過程[23]。Zhang等[24]通過體外實驗證實，子宮內膜基質細胞NF-κB通路的激活會促進細胞的增殖、遷移和侵襲。EMs患者內異組織、外周血等均存在NF-κB通路的過度活化[25,26]，并伴有E-cadherin、MMPs表達增多， TIMPs表達下降[25,27,28]。E-cadherin、MMP-2、MMP-9均為遷移和侵襲相關因子，在腫瘤細胞、滋養細胞等細胞中均被證實與細胞的遷徙、侵襲密切相關。其中E-cadherin屬于I型經典粘鈣蛋白，是有效的腫瘤抑制因子，E-cadherin的下降與腫瘤的發生、擴散相關[29]。在EMs的研究中，EMs疾病進程與E-cadherin呈負相關[30]，在位內膜較異位內膜組織E-cadherin水平高[31]。MMPs是鋅依賴性內切蛋白酶家族，在組織重塑和細胞外基質多種蛋白的降解中具有重要作用。MMPs受TIMPs抑制性調節，MMP/TIMP比值通常決定蛋白降解和組織重塑的程度[32]。研究發現，因EMs行IVF的女性血清和卵泡液中的MMP-2和MMP-9水平升高，TIMP-1水平下降，并與卵泡質量下降和胚胎發育異常相關[33]，MMP-2、MMP-9可以作為EMs組織或細胞侵襲能力以及治療有效性的檢測指標[33,34]。

本實驗研究中，用miR-199a抑制劑處理EnSCs后，發現NF-κB通路IKKβ、NF-κBp65的蛋白水平均上調，pIκB-α的水平也上調，表面miR-199a負性調節NF-κB通路；而后用siRNA敲除NF-κBp65，發現E-cadherin與TIMP-1的mRNA和蛋白表達上調，而MMP-2與MMP-9的mRNA和蛋白表達下調，表明在EnSCs中，NF-κB的過度活化同樣和細胞的遷移、侵襲相關。本實驗證實在EnSCs中，miR-199a通過負性調控NF-κB通路，抑制EnSCs的遷移和侵襲，從而抑制EMs的發生和進展。

Maged等[35]通過對45名EMs患者和35名因其他病行腹腔鏡的患者進行前瞻性隊列研究，發現EMs患者血清和腹腔液miR-199a水平升高，對EMs診斷的敏感性和特異性均為100%。Wang等[36]同樣發現EMs患者血清miR-199a上調，并與EMs病變程度、病變分布和骨盆粘連密切相關，miR-199a結合miR-122、miR-145 *和miR-542-3p診斷EMs的敏感性為93.22%，特異性為96.00%。在國內，袁琳等[37]同樣證實EMs患者血清及腹腔液中miR-199a-5p表達增加。這些關于研究證實EMs患者血清和腹腔液中上調的miR-199a可以作為EMs診斷的新靶標。然而多數研究表明EMs病灶組織和細胞中mir-199下調導致了EMs的發生。要對這一相反的結果進行驗證，首先有待于更多實驗證實血清、腹腔液和EMs組織、細胞中的miR-199a變化趨勢；其次考慮可能原因為miR-199a在EMs患者機體中的分布存在異常，或血清、腹腔液中的miR-199a與EMs病灶組織和細胞中的mir-199存在某種負反饋機制，這些猜想有待于進一步的實驗明確mir-199的來源、分泌和分布等。

本實驗研究證實了miR-199a對EnSCs黏附、侵襲能力的抑制作用和機制，為通過miR-199a及其下游靶標NF-κB通路降低EnSCs的侵襲，從而治療EMs患者，尤其是手術或激素治療效果不佳、二次復發的患者帶來了新的希望。