下調miR-711靶向促進SIRT6表達抑制LPS誘導心肌細胞凋亡的影響和機制研究

王艷 顏治 詹洮

心肌細胞凋亡是多種心血管系統疾病發生的重要原因，其也是心肌炎、心肌梗死等心臟相關疾病進展程度的評價指標[1]。膿毒癥心臟損傷是常見的心血管系統疾病，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一，也是膿毒癥發生的誘導因子[2]。miRNA是近些年來備受青睞的分子生物學標記物，其不僅是評估心血管系統疾病患者預后情況、進展程度的重要指標，也是疾病治療的潛在靶點[3]。研究顯示，miRNA在血管內皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞等各種類型細胞中表達，并且與細胞正常生理功能發揮有關[4]。miR-711在人體內脾臟、肝臟、心臟、腎臟等組織中表達，參與急性肝損傷、腫瘤、心肌纖維化等疾病發生[5]。研究報道顯示，miR-711在心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死發生時表達上調，并且下調miR-711表達可以減少缺氧誘導的心肌細胞凋亡，miR-711可能是一個心肌細胞促損傷因子[6,7]。目前對miR-711在膿毒癥心肌細胞凋亡中的作用及調控機制還不明確。本次實驗以心肌細胞H9c2為體外實驗對象，探討miR-711在LPS條件下心肌細胞凋亡中的作用和靶向調控機制，以期為靶向基因改善膿毒癥心肌損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細胞H9c2購自上海酶研生物細胞庫；inhibitor control、miR-711 inhibitor購自廣州市銳博生物科技有限公司；LPS購自上海一研生物科技有限公司；Bax抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；Bcl-2抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；沉默信息調節因子2相關酶6(silent information silent information regulation 2 homolog-6,SIRT6)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；SIRT6 siRNA、siRNA control均由吉滿生物科技(上海)有限公司構建合成。

1.2 細胞分組處理 心肌細胞分為Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS組。Control組：為空白對照細胞；LPS組：細胞以25 mg/L的LPS細胞培養液培養；Anti-NC+LPS組：在細胞中轉染inhibitor control，以25 mg/L的LPS細胞培養液培養；Anti-miR-711+LPS組：在細胞中轉染miR-711 inhibitor，以25 mg/L的LPS細胞培養液培養。心肌細胞培養液為：添加10%胎牛血清的DMEM。細胞生長密度達到60%時，按照轉染試劑Lipofectamin 2000操作說明將inhibitor control、miR-711 inhibitor分別轉染到心肌細胞中。

1.3 Realtime PCR檢測miR-711表達 收集培養1 d以后的Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS組細胞，添加Trizol試劑提取細胞RNA，RNA溶解在無RNase水中，保存在-80℃。逆轉錄合成cDNA，逆轉錄引物為：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTC-3’，逆轉錄體系為：0.1%的BSA溶液2 μl、2×miRNA Reaction buffer mix溶液10 μl、miRNA Primescript RT Enzyme mix溶液2 μl、總RNA 1 μl，最后加RNase free dH2O補足至20 μl。逆轉錄反應條件為：poly(A)加尾反應以及逆轉錄反應(37℃孵育60 min×2)，逆轉錄酶失活反應(85℃孵育5 s)。Realtime PCR引物如下：上游5’-ACTTTGAGTCTCTCCTCAGGGTG-3’，下游5’-TCTCCCCTCACTTACGTCTCTCCC-3’，以U6作為內參，進行Realtime PCR反應，反應體系如下：SYBR Green Premix溶液10 μl、上下游引物各0.8 μl、cDNA模板2 μl，最后加ddH2O補足至20 μl，PCR反應程序為：預變性(95℃孵育30 s)、變性(95℃孵育20 s)、退火延伸(60℃孵育20 s)，共40個循環。以2-ΔΔCt法計算miR-711表達量。

1.4 MTT測定細胞活力 按照Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS組分組處理方法將細胞接種到96孔板內，每孔100 μl，放在37℃培養箱內培養1 d。取出培養板，添加體積為20 μl的MTT工作液，繼續孵育4 h。把孔內上清溶液棄掉，添加150 μl的DMSO溶液，震蕩反應10 min。酶標儀上測定每個孔的吸光度值(Absorbance，A值)。

1.5 流式細胞術測定細胞凋亡 收集培養1 d以后的Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS組細胞，以PBS洗滌細胞，1 000 g離心10 min，將上清吸棄后添加200 μl的結合緩沖液，再加入Annexin V-FITC溶液10 μl、PI溶液5 μl，置于室溫條件下結合反應15 min。添加300 μl的結合緩沖液混合后，用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡變化。

1.6 Western blot測定Bax、Bcl-2蛋白表達 收集培養1 d以后的Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS組細胞，用冰預冷后的PBS溶液將細胞輕輕洗滌3次，添加細胞裂解溶液，在冰上靜置反應30 min。收集細胞裂解溶液，12 000 g離心20 min，將上清收集至EP管中，保存在-80℃。分別配制10%的分離膠以及5%的濃縮膠，在加樣孔內添加40 μg蛋白。蛋白樣品在上樣之前需要與上樣緩沖液混合煮沸5 min。電泳電壓設置為恒壓100 V，肉眼觀察藍色染料快要跑出玻璃板底部邊緣時終止電泳。采用半干式進行電轉，以2.5 mA/cm2恒流轉膜。轉膜結束后取出NC膜，以5%的脫脂奶粉將非特異性結合位點封閉，然后放在一抗溶液中反應2 h，最后放在二抗溶液中孵育2 h。一抗均以1∶800稀釋，二抗以1∶2 000稀釋。采用ECL顯色試劑盒顯色。β-actin作為參照，根據條帶的灰度值分析目的蛋白表達量，灰度值分析用Image J。

1.7 miR-711靶基因預測和鑒定 采用生物信息學軟件targetscan分析預測miR-711的靶基因，SIRT6的3，UTR端與miR-711有結合位點。利用熒光素酶報告系統鑒定靶向關系。SIRT6 野生型(wt)和突變型(mut)熒光素酶報告載體由重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司構建。把構建好的wt和mut熒光素酶報告載體分別與inhibitor control、miR-711 inhibitor共轉染到心肌細胞中，培養1 d后，熒光素酶活性測定試劑盒檢測心肌細胞熒光素酶活性。

1.8 SIRT6 siRNA對下調miR-711影響心肌細胞活力和凋亡作用檢測 分別將miR-711 inhibitor、siRNA control和miR-711 inhibitor、SIRT6 siRNA共轉染到心肌細胞中，以25 mg/L的LPS細胞培養液培養，記為Anti-miR-711+LPS+si-NC和Anti-miR-711+LPS+si-SIRT6組，按照上述步驟用MTT、流式細胞術、Western blot方法測定細胞活力、凋亡和Bax、Bcl-2、SIRT6蛋白水平。

2 結果

2.1 miR-711 inhibitor下調LPS條件下心肌細胞中miR-711表達水平 與Control組比較，LPS組細胞中miR-711表達水平升高(P<0.05)；與Anti-NC+LPS組比較，Anti-miR-711+LPS組細胞中miR-711表達水平降低(P<0.05)；LPS處理后的心肌細胞中miR-711表達水平升高，miR-711 inhibitor下調LPS條件下心肌細胞中miR-711表達水平。見表1。

表1 miR-711 inhibitor轉染前后LPS條件下miR-711表達水平比較

2.2 下調miR-711對LPS條件下心肌細胞活性和凋亡影響 與Control組比較，LPS組細胞活力降低，細胞凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Anti-NC+LPS組比較，Anti-miR-711+LPS組細胞活力升高，細胞凋亡率降低，細胞中Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；LPS處理后的心肌細胞活性降低，細胞凋亡增加；下調miR-711提高LPS條件下心肌細胞活性并減少細胞凋亡。見圖1、2，表2。

圖2 Western blot測定Bax、Bcl-2蛋白表達

表2 miR-711 inhibitor轉染前后LPS條件下心肌細胞活力(A值)、凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

2.3 miR-711靶向調控SIRT6 miR-711與SIRT6的3，UTR端有結合位點，miR-711 inhibitor和wt共轉染后的心肌細胞熒光素酶活性升高，miR-711靶向調控SIRT6。見圖3,表3。

表3 wt和mut轉染后心肌細胞熒光素酶活性變化

圖3 miR-711和SIRT6結合位點示意圖

2.4 下調miR-711提高LPS條件下心肌細胞中SIRT6蛋白表達 與Control組比較，LPS組細胞中SIRT6蛋白表達水平降低(P<0.05)；與Anti-NC+LPS組比較，Anti-miR-711+LPS組細胞中SIRT6蛋白表達水平升高(P<0.05)。LPS處理后的心肌細胞中SIRT6蛋白表達減少；下調miR-711提高LPS條件下心肌細胞中SIRT6蛋白表達水平。見圖4，表4。

圖4 Western blot檢測miR-711 inhibitor轉染后LPS條件下心肌細胞中SIRT6蛋白表達變化

表4 miR-711 inhibitor轉染前后LPS條件下心肌細胞中SIRT6蛋白水平

2.5 SIRT6 siRNA逆轉下調miR-711對LPS條件下心肌細胞活力和凋亡影響 與Anti-miR-711+LPS+si-NC組比較，Anti-miR-711+LPS+si-SIRT6組細胞活力降低，凋亡率升高，Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2、SIRT6蛋白表達水平降低。SIRT6 siRNA逆轉下調miR-711對LPS條件下心肌細胞活力和凋亡影響。見圖5、6，表5。

圖5 流式細胞術測定細胞凋亡

圖6 Western blot測定Bax、Bcl-2、SIRT6蛋白表達

表5 miR-711 inhibitor、SIRT6 siRNA轉染前后LPS條件下心肌細胞活力(A值)、凋亡率和細胞中Bax、Bcl-2、SIRT6蛋白水平

3 討論

LPS又稱為內毒素，是引起膿毒癥心肌損傷的重要因子[8]。LPS可以誘導心肌細胞凋亡，這也是多種感染性心肌相關疾病發生的機制之一[9]。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2蛋白家族成員，二者均參與細胞凋亡過程，Bax具有促進細胞凋亡的作用，而Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用[10]。本次實驗結果表明，LPS處理后的心肌細胞活力下降，細胞凋亡水平升高，Bax蛋白表達水平上調，Bcl-2蛋白表達水平下降，提示LPS誘導心肌細胞凋亡，這與上述研究結果相符合，說明成功構建了LPS誘導心肌細胞凋亡模型。

miRNA是一類短鏈小RNA，其可以在轉錄后水平影響靶基因的表達，miRNA在機體能量代謝、組織發育、疾病進展等過程中發揮多種生物學作用[11]。miRNA參與心臟發育，并且與心臟疾病發生有關[12]。miR-711屬于內含子miRNA，其在人和鼠之間只有2個堿基不同，屬于相對保守的miRNA[13]。miR-711與細胞凋亡、生長、纖維化有關，參與腫瘤外泌體、心血管系統疾病、炎癥以及內分泌相關疾病進程[6,14-16]。研究報道顯示，miR-711在心肌缺血損傷中表達上調，抑制miR-711具有減少心肌細胞凋亡的作用[6,7]。本次實驗表明，LPS處理后的心肌細胞中miR-711表達水平升高，并且下調miR-711可以提高心肌細胞活力，減少細胞凋亡和Bax蛋白表達，促進Bcl-2蛋白表達，提示下調miR-711可以抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡，miR-711可能是LPS心肌損傷的促進因子。

miRNA在經過非編碼區轉錄以后產生pri-miRNA分子，pri-miRNA在細胞核內經過雙鏈RNA核酸酶特異性處理以后能夠形成pre-miRNA發夾結構，pre-miRNA轉運至細胞質并經核酸酶剪切加工為成熟的miRNA[17]。miRNA通過與其靶mRNA復雜作用而發揮多種功能[18]。本次實驗顯示，miR-711靶向負調控心肌細胞中SIRT6表達，miR-711作用機制可能與SIRT6有關。SIRT6是沉默信息調節因子2的同源蛋白，其具有ADP-核酸轉移酶以及去乙酰化酶活性，在DNA修復、炎癥、基因組穩定、代謝、衰老等過程發揮作用[19，20]。SIRT6與心血管系統疾病有關，在心肌肥大、心力衰竭、心肌纖維化、心肌缺血再灌注等心臟疾病中發揮作用，SIRT6能夠明顯改善心肌細胞損傷[21，22]。本次實驗表明，下調SIRT6可以逆轉下調miR-711對LPS條件下心肌細胞凋亡的抑制作用，這進一步證實下調miR-711抗LPS心肌細胞凋亡與靶向促進SIRT6表達有關。

以上表明，下調其表達可以提高LPS條件下心肌細胞活力，減少細胞凋亡，作用機制與促進SIRT6表達有關，miR-711在膿毒癥心肌細胞凋亡中可能發揮促進作用，靶向抑制miR-711可能是膿毒癥心肌損傷治療的途徑。本次實驗為研究miR-711在心血管系統疾病發生中的作用和機制提供了資料，今后會在體內進一步探討miR-711的功能和機制。