SIX1 和TGF-β在人喉鱗癌上皮-間質轉化中的作用

張繼華 米楠楠 崔旭媛 蘇靜 梅文華

在惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉移過程中上皮-間質轉化(EMT)起著重要的作用，這一過程是由多個信號傳導途徑觸發和調控的，這些信號途徑能夠對細胞外的刺激產生應答而激活。在這些傳導途徑中，轉化生長因子-β(TGF-β)途徑被認為是最重要的途徑之一[1,2]。以往研究表明SIX1同TGF-β相互作用能偶促進多種惡性腫瘤細胞淋巴結的轉移[3]，但他們具體的相互作用機制以及對惡性腫瘤細胞EMT的影響尚不明確，三者在人喉鱗癌中的相互作用仍少見報道。本研究對96例人喉鱗癌患者腫瘤組織及32例腫瘤周圍正常喉黏膜組織中同源異形框基因(SIX1)、轉化生長因子-β(TGF-β)以及E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及其 mRNA的表達進行了檢測，旨在探討SIX1、TGF-β在人喉鱗癌上皮-間質轉化中的作用及相關作用機制，為臨床喉癌的診治、判斷人喉解癌的轉移及預后提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集并整理2015年1月至2017年12月河北醫科大學第一醫院收治的96例住院喉鱗狀細胞癌患者標本及病歷資料(患者術前均未經放化療)，其中診斷聲門上型患者58例，聲門型患者38例；32例癌旁正常喉黏膜組織取自距離腫瘤切緣≥0.5 cm(病理檢查確認無腫瘤細胞存在)。96例喉鱗癌組織樣本具體情況如下，男79例，女17例；年齡32～76歲，平均(58.6±7.0)歲；淋巴結轉移39例(T1N1M06例，T1N2M05例，T2N1M08例，T2N2M09例，T3N1M07例，T3N2M02例，T4N1M02例，T4N2M00例)，無淋巴結轉移57例(T1N0M014例，T2N0M018例，T3N0M013例，T4N0M012例)；臨床分期：Ⅰ期22例,Ⅱ期28例,Ⅲ期35例，Ⅳ期11例。腫瘤分化程度：高分化45例，中分化16例，低分化35例。所有實驗樣本，經病理科兩位副高以上職稱醫生確認。

1.2 主要試劑與儀器 SIX1免疫組化用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度為1∶75。TGF-β免疫組化用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度均為 1∶55。E-cadherin免疫組化用多克隆抗體，北京奧維亞生物技術有限公司，工作濃度為1∶50。免疫組化用SP染色試劑盒、DAB顯色用試劑，北京中杉金橋生物公司。第一鏈合成cDNA試劑盒，Fermentas 公司。擴增試劑盒GoTaq Green Master Mix，Promega公司。上下游引物，北京奧科生物公司。培養箱：MCO175型二氧化碳培養箱，日本三洋。倒置顯微鏡X-PC-2型倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色:修剪留取組織標本，常規脫水、固定、石蠟包埋，蠟塊進行連續切片，厚度5 μm，SP法(參照說明書)免疫組織化學染色，固定、封片，鏡下判讀組化染色結果。

1.3.2 結果判斷:采用半定量雙評分法，顯微鏡高倍鏡視野下根據陽性細胞所占比例以及細胞染色強度做綜合判定。表達強度評分標準：不著色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。陽性細胞所占視野細胞比例評分標準：陽性細胞百分率<25% ，記0 分；陽性細胞百分率25%～50% ，記1 分；陽性細胞百分率51%～75%，記2分；陽性細胞百分率>75%，記3分。兩種方法所得評分和，0～1為目的蛋白陰性(-)；2為目的蛋白弱陽性(+)；3～4為目的蛋白陽性(++)，5～6為目的蛋白強陽性(+++)。

1.3.3 Western 法測腫瘤細胞內SIX1、TGF-β和E-cadherin蛋白表達:參照試劑說明書，提取樣本蛋白，制備Western blot檢測樣品，檢測各組樣品蛋白濃度，常規上樣，配制選用12%分離膠以及4%濃縮膠，每組樣品上樣量65 μg，同時設置Marker預染蛋白，100 V電泳約85 min，轉膜30 V，0.9 mA過夜。洗膜，定影后進行圖像分析。

1.3.4 RT-PCR測定腫瘤組織細胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA：Trizol法提取樣本腫瘤細胞總的RNA，檢測各組樣本細胞濃度，確定樣本細胞RNA完整，cDNA反轉錄合成，取轉錄產物2 μl進行PCR反應。GAPDH，上游 5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’,下游 5’-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’;SIX1：上游5’-CCACTAGAAGAGGAATT-3’，下游5’-CACGCCGGAGCCAAACT-3’，產物大小254 bp，退火溫度56.3℃； TGF-β：上游 5’-CTGTAATTCTGCTGTAATA-3’，下游 5’-GGCTTAGTATTCTGGGAAA-3’，產物大小287 bp，退火溫度54.2℃；Ecadherin:上游 5’-AGGCCAAGCAGCAGTACATT-3’ ，下游5’-ATTCACATCCAGCACATCCA-3’，產物大小為288 bp，退火溫度為56.6℃。反應條件如下：94℃變性1 min，57℃復性1 min，75℃延伸1 min，共設計32個循環，最后設計75℃延伸10 min。以GAPDH的熒光表達量度作為檢測基因表達參照量。

2 結果

2.1 免疫組化檢測SIX1、TGF-β以及E-cadherin蛋白在人喉鱗狀細胞癌及喉正常黏膜組織中的表達 96例人喉癌組織標本中及32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中E-cadherin的陽性表達率分別為21.9%(21/96)和81.3%(26/32)；SIX1的陽性表達率分別為88.5%(85/96)和12.5%(4/32)；TGF-β的陽性表達率分別為86.5%(83/96)和18.8%(6/32)。喉鱗狀細胞癌SIX1、TGF-β陽性表達率均高于癌旁正常黏膜E-cadherin低于癌旁正常黏膜組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1，見圖1。

表1 SIX1、TGF-β and E-cadherin蛋白在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達情況 例(%)

A(+++)B(+++)C(+)

2.2 Western Blot檢測SIX1、TGF-β 和E-cadherin蛋白在人喉鱗狀細胞癌及喉正常黏膜組織中的表達 喉鱗狀細胞癌中SIX1、TGF-β蛋白表達明顯高于癌旁正常黏膜，E-cadherin蛋白表達明顯低于癌旁正常黏膜，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 SIX1、TGF-β and E-cadherin在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達情況

2.3 PCR測定人喉鱗癌組織中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA的表達 96例人喉癌組織標本中及32例瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中E-cadherin的陽性表達率分別為22.9%(22/96)和78.1%(25/32)；SIX1的陽性表達率分別為89.6%(86/96)和9.3%(3/32)；TGF-β的陽性表達率分別為85.4%(82/96)和15.6%(5/32)。喉鱗狀細胞癌SIX1、TGF-β陽性表達率均高于癌旁正常黏膜，E-cadherin陽性表達率低于癌旁正常黏膜，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 SIX1、TGF-β and E-cadherin mRNA在喉鱗癌及癌旁正常喉黏膜中的表達情況 例(%)

2.4 SIX1、TGF-β 和E-cadherin蛋白表達與喉鱗癌患者臨床病理特征的關系 有淋巴結轉移的患者中，喉鱗癌組織中SIX1的陽性表達率高于無淋巴結轉移的患者(P<0.05)，同時在中低分化患者中SIX1的陽性表達率高于其在高分化患者中的表達(P<0.05)。不同性別、年齡、臨床分期的患者喉癌組織中SIX1的陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。有淋巴結轉移的患者中，喉鱗癌組織中TGF-β的陽性表達率高于無淋巴結轉移的患者(P<0.05)。不同分化程度的喉鱗癌組織中TGF-β陽性表達率比較，差異無統計學意義。不同性別、年齡、臨床分期的患者喉癌組織中TGF-β的陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。有淋巴結轉移的患者中，喉鱗癌組織中E-cadherin的陽性表達率低于無淋巴結轉移的患者(P<0.05)。同時在中低分化患者中，E-cadherin的陽性表達率低于其在高分化患者中的表達(P<0.05)。不同性別、年齡、臨床分期的患者喉癌組織中E-cadherin的陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5 Six1、TGF-β和E-cadherin在人喉鱗癌患者腫瘤組織中表達相關性 人喉鱗癌組織中E-cadherin的表達與SIX1表達呈負相關(P<0.05)；E-cadherin的表達與TGF-β表達呈負相關(P<0.05)。見表5。

表5 喉鱗癌組織中Six1、TGF-β和E-cadherin表達的相關性 例

3 討論

EMT是指腫瘤上皮細胞在一定的環境及相應轉化因子等共同因素的相互影響下逐步轉變成充質細胞的現象[4]。目前多數學者認為EMT是惡性腫瘤生長、轉變的過程之一，同惡性腫瘤細胞的局部浸潤及遠處淋巴轉移緊密相關。EMT轉化的過程主要表現為，原腫瘤上皮細胞極性逐漸消失，上皮細胞及其與其周圍其他細胞的接觸相應減少，細胞間的連接，包括黏附連接及緊密連接減少，使得細胞脫離的機會增加，易于發生局部浸潤及發生遠處遷移，EMT的發生會出現原有上皮細胞表型的轉變，其上皮表型如E-eadherin、角蛋白絲等消失，間質表型，纖維連接蛋白，N-鈣粘素等逐漸形成。其中代表細胞間黏附力的E-cadherin表達下降是ENT的主要表現，也被視為EMT轉化的標志[5]。實驗研究表明，EMT同腫瘤細胞向局部浸潤和淋巴轉移的過程密切相關，EMT可誘導多種惡性腫瘤細胞局部侵潤和淋巴轉移，比如卵巢癌、肝癌、結腸癌及惡性黑色素瘤等[6-9]。因此，EMT被認為是多種上皮來源腫瘤轉移潛能的標志。

上皮間質轉化的過程是由多個信號傳導通路觸發和調控的，在這些信號傳導通路中，TGF-β被認為是最重要的途徑之一[10]。TGF-β能夠通過MAPK (mitogen-activated protein kinases)通路、SMAD通路及Wnt通路等途徑對腫瘤的浸潤及轉移進行調節，在大腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中均存在TGF-β的高表達[11]，其表達強度與腫瘤的分化、淋巴轉移及預后密切相關[12]。以往的研究證實，TGF-β能夠被細胞中的多種活性因子激活，并與這些因子共同作用，激活及影響細胞內多種傳導通路，但腫瘤細胞中轉錄因子的高表達能否增強TGF-β途徑在誘導人喉鱗癌EMT過程中的作用尚不清楚。

SIX1是一種成熟相關的細胞因子，在發育成熟的細胞內很少表達，然而最近研究表明，SIX1在多種惡性腫瘤組織中卻呈現出高表達，SIX1能夠影響Cyclin A1、Cyclin D1及Ezrin等多種下游編碼基因的表達[13-16]。SIX1在卵巢癌、乳腺癌、肝細胞癌等多種惡性腫瘤中表達強度同腫瘤的預后密切相關[12-14]。最近研究證明，SIX1 能夠與TGF-β共同作用，并通過SMAD2/3途徑調節VEGF等多種基因的表達，進而發揮其促進腫瘤細胞淋巴結轉移功能，基于以上研究結果，本研究的目的在于，探討SIX1與TGF-β是否在人喉鱗癌EMT的過程中起著促進作用。

研究表明， SIX1能夠同TGF-β共同作用促進腫瘤細胞上皮-間質轉化，進一步提高腫瘤細胞局部浸潤及遠處轉移的能力[17]。本研究結果顯示，Six1、TGF-β蛋白在人喉鱗癌組織中均出現了陽性表達，同癌周正常黏膜相比出現了明顯的增強，提示Six1、TGF-β同喉鱗癌的發生發展密切相關。同時研究結果顯示，在有淋巴結轉移組中Six1、TGF-β蛋白的陽性表達率明顯升高，同無淋巴結轉移組相比差異有統計學意義，同時，E-cadherin陽性表達率在有淋巴結轉移組中出現了降低，同無淋巴結轉移組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。相關性研究結果顯示，Six1、TGF-β的表達與E-cadherin表達呈負相關(P<0.05)，提示， SIX1及TGF-β可能是調節喉鱗癌上皮-間質轉化的重要影響因子，二者的高表達可能共同促進了喉鱗癌的上皮-間質轉化，抑制了E-cadherin蛋白的表達，進而促進人喉鱗狀細胞癌的淋巴結轉移。同時PCR測定人喉鱗癌組織中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA的表達結果顯示人喉癌組織標本及瘤體周圍正常喉黏膜組織標本中E-cadherin mRNA的陽性表達率同其蛋白的陽性表達率基本一致，說明上述表達變化發生在基因表達水平。

本課題對SIX1、TGF-β在人喉鱗癌上皮-間質轉化中的作用做了初步探討。結果提示，SIX1和TGF可能成為抑制喉鱗癌EMT發生的重要因素，聯合檢測SIX1、TGF-β及E-cadherin對判斷人喉鱗癌的轉移及預后有重要臨床意義。