聚蘋果酸高產菌的篩選與鑒定

呂磊磊，周丹鳳，陳林杰，魏培蓮

（浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江杭州 310023）

聚蘋果酸（Poly malic acid，PMA）最早是由Shimada等[1]從圓弧青霉菌（Penicillium cyclopium）中分離得到，現已被確定是一種無毒性、具有生物可降解性和生物相容性的水溶性聚酯類高分子材料[2?6]，在生物材料[7?8]、醫藥載體[9?11]等方面極具市場前景。PMA由L-蘋果酸單體組成，具有3種構型：α型、β型、γ型，而微生物合成的PMA只有β型[12?13]。目前PMA的制備通常采用化學合成法或微生物發酵法。化學合成法可以得到3種構型的PMA，但材料來源單一，能耗高，對設備要求嚴格，無法滿足綠色制造的要求[14?15]；而生物發酵生產PMA具有條件溫和、產物純度和分子量較高等優點，且能使用可再生資源，符合綠色環保理念，目前備受國內外研究人員的關注[16?17]。

現有研究表明短梗霉、環狀青霉和多頭絨泡菌等菌株都可以用于發酵制備PMA[18]，其中短梗霉不僅形態穩定，易于實現發酵過程中的有效調控，其合成PMA的能力也高于其他菌種[19]。短梗霉屬存在4個變種[20]，分別是：A. pullulans，A. melanogenum，A. subglaciale和A. namibiae，其中A. pullulans是生產PMA的主要菌種。目前PMA的生產菌種由于發酵周期較長、單位時間內產量較低、生產成本偏高等因素，微生物發酵制備PMA還未見成功商業化應用的報道。通過自然篩選或遺傳改造來獲得高產菌株是提高PMA發酵產量、實現微生物發酵制備PMA的有效手段。已有一些研究者開展了這方面的工作，獲得了一些高產菌[17?18,21]。本研究擬從自然界取樣進行PMA高產菌的分離篩選工作，以期獲得PMA的高產菌株，為PMA的工業化生產提供新的菌種來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采樣樣本：花（編號Ⅰ-1～15）、土壤（編號Ⅱ-1～10）、樹葉（編號Ⅲ-1～20）、草葉（編號Ⅳ-1～15），共計60個 均取自校園及周邊；L-蘋果酸標準品 純度>99%，國藥集團化學試劑有限公司；硫酸 純度95%～98%，無水乙醇 純度≥99.7%，上海凌峰化學試劑有限公司；乙腈 色譜純，安徽天地高純溶劑有限公司；培養基配方所用藥品和試劑 均為分析純；菌種保藏培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA））：馬鈴薯粉 0.6%，葡萄糖 2%，瓊脂 2%；富集培養基：甘露醇10%，NH4NO30.1%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.02%，檸檬酸 0.2%，Span 80 0.02%；分離培養基（含氯霉素PDA）：馬鈴薯粉 0.6%，葡萄糖 2%，瓊脂 2%，氯霉素 0.01%；種子培養基：葡萄糖 5%，蛋白胨0.1%，酵母提取物 0.1%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.04%，NaCl 0.1%；發酵培養基：葡萄糖 12% ，NH4NO30.1%，KH2PO40.01%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCO33%（單獨滅菌，接種前加入）。

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；生化恒溫培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；SKY-2102C恒溫培養搖床上海蘇坤實業有限公司；BA310T生物顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；SU1510掃描電鏡 日立高新技術公司；TDZ4-WS臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；e2695高效液相色譜儀美國Waters。

1.2 實驗方法

1.2.1 高產PMA菌株的篩選 分離篩選流程如下：自然界取樣→富集培養→涂布分離→劃線純化→離心管發酵初篩→搖瓶發酵復篩→斜面保藏

1.2.1.1 富集與菌落分離純化 將適量樣品剪碎后置于裝有10 mL富集培養基的30 mL離心管中，28 ℃、180 r/min搖床培養2～3 d，直至培養液中有明顯渾濁出現；將培養液震蕩搖勻后，取1 mL菌液適當稀釋后，移取100 μL稀釋液于分離培養基上涂布，28 ℃恒溫培養2～3 d。定期觀察平板菌落生長情況，根據菌落形態特征選擇單菌落，進行平板劃線純化。如果一個平板上生長有多個類似目的菌落，則用a、b等加以區別，如1a、1b。

1.2.1.2 離心管發酵初篩 從分離平板挑取純化后單菌落于裝有15 mL發酵培養基的50 mL離心管中，28 ℃，180 r/min搖床培養7 d后，取發酵液檢測，有PMA產生的作為初篩目標菌株。1

.2.1.3 搖瓶發酵復篩 取初篩目標菌株的單菌落于PDA斜面上，28 ℃培養箱培養2～3 d后，取2環于裝有50 mL種子培養基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、180 r /min搖床培養2 d，再以6%的接種量接種到發酵培養基中，28 ℃，180 r/min搖床培養7 d，測定發酵液中PMA產量，以產量較高的菌株為復篩目標菌株，并做進一步研究。

1.2.2 發酵產物的分析鑒定

1.2.2.1 有機溶劑法定性檢測PMA 在初篩研究中采用乙醇沉淀法[22]對發酵液中的PMA進行定性檢測分析。參考已有研究[23]，將發酵液4000 r/min離心15 min后，取上清液加入2.8倍體積無水乙醇，立即觀察到有明顯絮狀沉淀產生或者溶液離心后有沉淀產生，即說明發酵液中有PMA生成，通過觀察沉淀生成情況，可初步判斷菌株產PMA的能力。

1.2.2.2 高效液相色譜法鑒定PMA 目前主要是將聚蘋果酸水解為L-蘋果酸單體進行檢驗測定，通過檢測水解前后發酵液中L-蘋果酸含量的變化，一方面確定發酵液中含有PMA，另一方面是以L-蘋果酸的濃度換算獲得PMA的濃度。

復篩研究中采用高效液相色譜法（HPLC）對目標菌株的發酵液進行測定，方法參考文獻[24?25]。樣品處理方法：將復篩目標菌株的發酵液在4000 r/min條件下離心15 min，取上清液兩份，其中一份加入等體積1 mol/L H2SO4，90 ℃水浴水解9 h。上清液和水解液各稀釋20倍，用0.22 μm微孔濾膜過濾，置于進樣瓶中，用于L-蘋果酸的HPLC檢測。

HPLC條件：色譜柱Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm 2.5 μm），紫外檢測器（檢測波長210 nm），柱溫25 ℃，進樣量50 μL。采用等度洗脫方式，流動相A為乙腈，流動相B為0.025 mol/L的KH2PO4緩沖溶液（pH 2.5），流速為 1.0 mL /min。

式中：CPMA表示PMA濃度，g/L；0.864表示L-蘋果酸與PMA的換算系數，ΔC蘋果酸表示酸水解前后L-蘋果酸的濃度差值，g/L。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態學特征鑒定 a.顯微形態觀察：取液體培養1 d的菌液100 μL制片，若菌體濃度過大，適當稀釋后，再取100 μL制片。在顯微鏡的視野里隨機選取單細胞進行細胞形態觀察，并拍照記錄菌體形態。

b.掃描電鏡觀察[27]：取液體培養2 d的菌液，4000 r/min離心15 min后倒去上清液，沉淀用適量5%戊二醛處理12 h；4000 r/min離心5 min后，將沉淀細胞用不同濃度梯度的乙醇（10%、20%、30%、50%、70%、90%、100%）進行脫水處理，每次脫水10 min；脫水完成后于40 ℃烘箱中烘干乙醇，再用棉簽蘸取少量樣品，鋪在載物臺導電膠上，噴金，電鏡觀察。

1.2.3.2 分子鑒定 菌種分子鑒定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。按照生工SK8259真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書，對鑒定菌種的細胞DNA進行提取，引物設計如下：

上游引物（ITS1）：5′TCCGTAGGTGAACCT GCGG 3′ (19 bp)

下 游 引 物（ITS4）：5′TCCTCCGCTTATTGA TATGC 3′ （20 bp）

PCR 25 μL反應體系設計如表1所示：

表1 PCR反應體系Table 1 The reaction system of PCR

PCR擴增條件如表2所示：

表2 PCR擴增條件Table 2 The amplification conditions of PCR

用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，按生工SK8131 DNA膠回收試劑盒說明書純化回收PCR產物，由委托公司進行序列測定。測序結果在NCBI上進行BLAST分析，搜索與其同源性高的基因序列，用MEGA 7軟件構建系統發育樹，確定菌種分類，最后由Banklt向NCBI提交基因序列，申請基因編號。

1.3 數據處理

采用Excel 2016作表，MEGA7軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩結果

富集培養后，在分離培養基上經劃線分離共獲得36個單菌落。對所有單菌落進行離心管發酵培養，采用乙醇沉淀法檢測是否有PMA產生（圖1）。經初篩得到21株產PMA菌株，通過觀察沉淀情況，初步判斷編號Ⅰ-2、Ⅰ-13a、Ⅲ-16菌株的產PMA能力較強（表3）。

圖1 乙醇沉淀結果Fig.1 Results of ethanol precipitation

2.2 菌株復篩結果

對初篩中產PMA的菌株進行搖瓶發酵復篩，HPLC測定發酵液中的PMA，結果見表4。從結果可以看出，分離自樣本編號為I-13a的菌株產量最高，PMA產量達到（43.08±0.36） g/L。

表4 菌株復篩結果Table 4 The results of secondary screening

2.3 發酵產物分析鑒定

對L-蘋果酸標準溶液和水解前后的發酵液進行HPLC檢測，結果顯示（圖2）L-蘋果酸的平均保留時間為3.190 min，RSD為1.11%，水解前后的樣品目的峰與標準品出峰時間一致，且發酵液經水解后L-蘋果酸的濃度大幅度升高（圖3、圖4），說明發酵液中含有L-蘋果酸的聚合物。

圖2 L-蘋果酸標準溶液的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of L-malic acid standard solution

2.4 高產菌株的鑒定

圖3 水解前發酵液的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of fermentation broth before hydrolysis

圖4 水解后發酵液的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of fermentation broth after hydrolysis

2.4.1 形態學鑒定 對篩選出的高產PMA菌株進行形態學觀察。編號I-13a菌株在分離平板上的菌落生長初期為淺粉色，外表有光澤，菌落邊緣呈現明顯根狀（圖5a），菌落生長后期逐漸變綠變暗，最終呈黑色皮革狀；菌體細胞在光學顯微鏡下呈卵圓形，大小相近，呈出芽方式增殖（圖5b）；在掃描電鏡下菌體細胞也呈現明顯的卵圓形，酵母樣，單個存在，大小為（20～30） μm×（40～50） μm（圖5c）。以上特征都與典型的短梗霉特征相似。

圖5 編號I-13a菌株的形態觀察結果Fig.5 Morphological observation results of strain I-13a

2.4.2 高產菌株的分子鑒定 提取編號Ⅰ-13a菌株的基因組DNA，經PCR擴增后回收測序，所測菌株ITS核苷酸序列長度為560 bp，電泳結果如圖6所示。將該序列提交到NCBI上進行BLAST分析，發現編號Ⅰ-13a菌株與Aureobasidium melanogenum的同源性最高，采用Neighbor-joining法構建了系統發育樹（圖7），再結合其形態學特征，確定編號Ⅰ-13a菌株屬于Aureobasidium melanogenum，并命名為ZUST-HD，GenBank庫登錄號為MK754072.1。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.6 The result of agarose gel electrophoresis

圖7 基于編號Ⅰ-13a菌株基因序列構建的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on gene sequence of strain Ⅰ-13a

3 結論與討論

本研究建立了富集培養、平板分離、離心管發酵初篩、搖瓶發酵復篩的分離篩選方法。經大量篩選獲得了一株PMA高產菌，產量達到（43.08±0.36） g/L。該菌株經初步鑒定屬于Aureobasidium melanogenum。

已有文獻報道中PMA的生產菌主要為Aureobasidiumpullulans[18,21,28]，Aureobasidium melanogenum相對較少。Aureobasidium melanogenum在生長過程中可產生一定量的黑色素，廣泛用于普魯蘭糖、黑色素、liamocin等的生產[29?31]。一般來說，黑色素的產生會影響菌株PMA的發酵產量和后期分離純化，但通過發酵過程中的代謝調節調控等手段可以限制副產物黑色素的生成，使得Aureobasidium melanogenum在生產PMA方面也有良好的研究應用[32]。目前文獻報道中PMA搖瓶發酵的產量多為26～30 g/L，通過發酵罐補料發酵、重復批次發酵等手段，可使產量進一步提高到50～110 g/L[33]。本研究所獲得的菌種初步搖瓶發酵產量為（43.08±0.36） g/L，高于大多數已報道菌株，經后期的培養基優化和發酵工藝改進產量還有望得到大幅度提高。該菌株在生產普魯蘭多糖和liamocin方面的能力也有待進一步探究。