不同香型白酒的風味物質及抗氧化作用分析

張明珠，吳學鳳，穆冬冬，蔡 靜，徐相輝，許博陽，孫 偉，梁 進，鄭 志，李興江,

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009；2.安徽文王釀酒股份有限公司，安徽臨泉 236400；3.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽省農產品加工工程實驗室，安徽合肥 230009）

白酒（Baijiu）是一種起源于中國的發酵型含酒精的飲料，與白蘭地、威士忌、伏特加、金酒和朗姆酒并稱為世界六大蒸餾酒。與其他蒸餾酒相同，白酒的乙醇含量高于其發酵物乙醇含量，可達38%～65%[1]。但其原料組成、生產工藝、口感滋味與其他蒸餾酒有很大的差別。各種香型的白酒在制作工藝以及使用原料上均存在一定的差異，正是這些差異的存在使其當中的風味物質含量以及種類發生變化，從而造成白酒風味的不同。此外，白酒除含有多種風味物質，還含有一些潛在的功能性成分，如氨基酸[2]和肽[3]，這些成分對人體是有益的。吳繼紅等[3]已經在芝麻風味型白酒中成功鑒定出四肽（Ala-Lys-Arg-Ala）和三肽（Pro-His-Pro），并顯示出對2-甲基丙酰亞胺脒鹽誘導的氧化效應具有預防作用。并且白酒還具有對HepG2細胞的抗性和抗高血壓的活性[3]。Xi等[4]發現輕度和中度酒精的攝入可能對美國中年人中由于心血管疾病造成的死亡有一定的保護作用，尤其對心血管系統有保護作用。白酒能夠在一定程度上清除自由基，自由基是生物體內新陳代謝過程中產生的一類具有高度活性的物質[5]，能導致生物膜、酶、維生素、蛋白質及活細胞功能出現過氧化損傷，對生物體危害很大。因此，適度飲用白酒可清除體內自由基[6]。

近年來，隨著分析技術的發展，對白酒風味物質的認知也上升到一個新的臺階，已經發現，在中國白酒當中化合物多達兩千多種，并且這兩千多種化合物大致可以分為兩類：一類是對風味有貢獻的，稱之為中國白酒當中的風味物質；另一類是對健康活性有貢獻的，稱之為中國白酒風味的活性物質。這兩類物質的豐富性和復雜性構成了中國白酒的獨特性。但是如何引導人們全面認識中國白酒釀造的科學性，如何科學地認識其特殊的生物活性成分、復雜的成分體系及其對人體健康的作用，如何證明適量飲用白酒是有益身體健康的，一直以來是白酒行業中的大問題，也對處在發展關鍵時期的中國白酒及其的健康發展尤為重要[6?7]。

目前關于芝麻香型白酒與人體健康這方面的研究較多，但對于其他香型白酒的研究較少。本研究以白酒風味和健康雙重發展的新趨勢[8]為基礎，應用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對幾種不同香型白酒的風味物質進行檢測分析，并對白酒清除自由基的能力進行測定，為進一步認識中國白酒風味物質成分和活性成分的特點提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃香型白酒（以下簡稱“Nong1、Nong2”，其中Nong1的酒精度為42%vol，原料為高粱、大麥、小麥、豌豆，Nong2的酒精度為52%vol，原料為水、高粱、小麥）、醬香型白酒（以下簡稱“Jiang”，Jiang的酒精度為53%vol，原料為水、高粱、小麥）、清香型白酒（以下簡稱“Qing”，Qing的酒精度為42%vol，原料為水、高粱、大麥、豌豆） 均購于家樂福超市。

50/30μmDVB/CAR/PDMS三相萃取頭、萃取手柄 美國Supelco公司；氣相色譜-質譜聯用儀GC6890N-MSD5975 美國Agilent公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司；TU-1810 T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 將酒樣用煮沸后冷卻的超純水進行稀釋，將其酒精度調至12%vol～13%vol。取8 mL的白酒酒樣于20 mL頂空瓶中，加入1.6 g的NaCl，在磁力攪拌器上進行攪拌預熱，再將老化后的萃取頭插入樣品瓶中，頂空吸附一定時間，然后在進樣口解析，進行GC-MS分析。為防止樣品間相互污染，每次樣品萃取前，萃取頭都要在250 ℃老化30 min。

參考高傳強[9]的芝麻香型白酒提取物的制備方法，修改前處理方法為：用雙蒸水首先將酒樣酒精度調至12%（V/V），然后取酒樣50 mL，加入到100 mL的離心管中，加入NaCl直至形成飽和溶液，進行超聲處理，設定單次超聲時間3.5 s，單次間隔時間1.5 s，總超聲時間30 min，超聲功率700 W，溫度控制在20 ℃，得到4種不同酒樣的超聲提取液。然后將4種不同的白酒提取物置于4 ℃冰箱中保存，直至進行白酒的抗氧化活性檢測。

1.2.2 GC-MS條件 根據Zheng等[10]所報道的GC-MS操作條件進行相應的修改，確定本研究的GC和MS條件分別為，柱溫箱升溫程序：40 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至64 ℃，然后再以4 ℃/min升溫至160 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，維持5 min。載氣為He，流速1 mL/min，不分流進樣。離子源溫度為250 ℃，電離電壓為70 eV，接線口溫度為250 ℃，四級桿溫度150 ℃，質量掃描范圍m/z 30～500。

定性定量方法：未知化合物經計算機檢索，與美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）數據庫相匹配，取匹配度大于75%的化合物進行質譜定性，并結合人工質譜檢測，定量使用面積歸一化法。

1.2.3 頂空固相微萃取條件優化 使用50/30 μm DVB / CAR / PDMS三相萃取頭對Nong1進行芳香化合物的萃取。HS-SPME的條件基于Du等[11]報道的方法進行相應的實驗優化。萃取的揮發性化合物在配備有HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）的氣相色譜-質譜儀上進行解析。取8 mL稀釋后酒樣置于20 mL樣品瓶中并加入1.6 g的NaCl。在50 ℃，轉子轉速200 r/min條件下，平衡10 min后，將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中，分別對其萃取吸附時間、萃取溫度及解析時間進行優化，萃取時間分別設定為30、35、40、45、50 min；萃取溫度為20、30、40、50、60 ℃；進樣口解析時間為1、5、10、15、20 min。根據實驗結果選擇較優條件，進行GC-MS分析。

1.2.4 白酒風味感官評價 選取10名評估員進行感官評價（男性女性各5名，年齡20～26歲）。通過感官小組評估4種白酒樣品的總體香氣特征，要求感官評價小組從果香味、甜香味、花香味、煙熏味、酒酸味、窖香味/干酪味、酒香味、果香味這8種芳香族屬性的氣味強度進行評價打分，從0分到5分（0為無，1為非常弱，2為弱，3為中等，4為強，5為非常強）。每個香氣屬性的值是10位評估者打分結果的平均值，平行測試3次[12]。

1.2.5 抗氧化活性分析

1.2.5.1 清除DPPH自由基能力 清除DPPH自由基能力按照式（1）計算[13]。在具塞的試管中分別按照參考文獻[12]的實驗順序要求加入所需試劑。反應10 min后，在分光光度計上以3 mL去離子水調零，以L-抗壞血酸作陽性對照。室溫下讀取517 nm波長處的吸光度值，平行測試3次，結果取平均值。式（1）中，A1為測定白酒提取液2 mL和DPPH· 1 mL的吸光度值；A2為測定白酒提取液2 mL和甲醇1 mL的吸光度值；A0為甲醇1 mL和DPPH溶液 1 mL的吸光度值。

1.2.5.2 清除羥自由基能力 清除羥自由基能力按照式（2）計算[13]。在具塞試管中分別依次加入試劑。然后將試管于37 ℃下水浴30 min，在分光光度計上以超純水調零，以L-抗壞血酸作陽性對照。室溫下讀取 510 nm 波長處的吸光度，平行測試3次，結果取平均值。式（2）中，A0為測定FeSO4溶液1 mL，水楊酸-乙醇溶液1 mL，甲醇1 mL和H2O2溶液1 mL的吸光度值；A1為測定FeSO4溶液1 mL，水楊酸-乙醇溶液1 mL，白酒提取液1 mL，H2O2溶液1 mL的吸光度值；A2為測定FeSO4溶液1 mL，水楊酸-乙醇溶液1 mL，白酒提取液1 mL，蒸餾水1 mL的吸光度值。

1.2.5.3 清除ABTS自由基能力 清除ABTS自由基能力按照式（3）計算[14]。取3 mg的ABTS和1 mg的K2S2O2分別溶于0.8 mL和1.5 mL蒸餾水中，振蕩搖勻。然后從上述溶液中各取0.2 mL進行混合，黑暗氧化12～16 h，臨用前用甲醇稀釋，使得其在734 nm處的吸光值為0.7±0.02。最后取1 mL白酒提取液加入4 mL的ABTS溶液，充分混勻后避光反應6 min，以超純水調零，以L-抗壞血酸作陽性對照。在734 nm處測量樣品的吸光度，平行測試3次，結果取平均值。

1.2.5.4 清除超氧陰離子自由基能力 清除超氧陰離子自由基能力按照式（4）計算[15]。取0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液3 mL，加入1 mL白酒提取液，放入25 ℃水浴鍋中水浴10 min，然后加入25 ℃預溫的0.06 mol/L的鄰苯三酚0.3 mL，充分混勻。準確反應3 min后加入3～4滴的5%抗壞血酸終止反應。10 min后在420 nm處測定吸光度，以0.01 mol/L HCl溶液調零，以等體積的超純水為對照組，平行測試3次，結果取平均值。

1.3 數據處理

數據以平均值±標準偏差（X±SD）表示。使用Origin 2018軟件進行圖形繪制，使用SPSS 21.0軟件做方差分析，差異顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的優化

本研究分別對其萃取吸附時間、萃取溫度及解析時間進行優化，以GC-MS所檢測的峰面積以及出峰個數為指標，根據試驗結果選擇最優風味物質萃取條件。

圖1 萃取時間（A）、萃取溫度（B）和解析時間（C）對實驗結果的影響Fig.1 Effect of extraction time (A), extraction temperature (B) and analytical time (C) on experimental results

研究結果（圖1）發現，當萃取時間為45 min時，出峰面積和出峰個數均高于萃取時間為30、35和40 min，繼續增加萃取時間至50 min時，出峰面積及個數并未繼續增加，這是因為揮發性風味物質在萃取纖維頭上存在著一個吸附解析的過程，在一定時間范圍內，萃取纖維頭上所吸附的化合物隨著時間的延長不斷增加，而進一步延長萃取時間，因為極性差異的存在，部分揮發性風味物質從萃取頭中分離，使得峰面積與峰個數降低，萃取到的風味物質種類與含量減少，故選擇分析白酒香氣物質的較優萃取時間為45 min；當萃取溫度為50 ℃時，出峰個數比萃取溫度為20 ℃時的出峰個數多20個，繼續升高萃取溫度至60 ℃，出峰面積和出峰個數均呈現下降趨勢，在實驗所選取的萃取溫度中，過高的溫度會使白酒中得揮發性風味物質發生變化，對結果分析造成影響。溫度過低會導致白酒中大部分風味成分揮發不充分或不能揮發，導致萃取到的物質種類含量明顯較低，故選擇分析白酒香氣物質的最佳萃取溫度為50 ℃。當解析時間為1 min時，出峰個數為僅為19個，當解析時間增加為10 min時，出峰個數增加，繼續增加解析時間，出峰個數反而稍有減少，這是由于在解析過程中揮發性風味物質在進樣口中隨著時間延長逐漸擴散直至分析物全部從萃取頭分離，進一步延長萃取時間由于溫度較高，分析物發生極性轉化依附在進樣口處，造成萃取到的風味成分種類和數量的降低。合適的解析時間不僅提高了實驗效率節省了實驗時間，還能大大提高所得萃取物的準確度與清晰度。故綜合考慮，選擇分析白酒香氣物質的較優解析時間為10 min。因此，通過單因素實驗所得到的較優HSSPME-GC-MS實驗條件為萃取時間45 min，萃取溫度為50 ℃，解析時間為10 min。

2.2 不同香型白酒揮發性風味物質對比分析

已有研究發現白酒中檢測到的微量物質主要包括醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、縮醛類、芳香族化合物、內酯類、呋喃類、萜烯類、烴類、含氮化合物、含硫化合物等[16]，其中有益于人體健康的物質主要有吡嗪類化合物、萜烯類化合物、亞油酸等多種活性功能成分[17]。本文在這些的研究基礎上，從白酒不同的香型出發，探究不同香型白酒的風味物質組成以及其抗氧化活性和特征。4種白酒揮發性風味物質總離子流圖及統計表見圖2和表1。

經分析，表1中所有檢測物質中Nong1當中共包含：醇類6種、酯類23種、酸類4種、醛類物質1種、醚類物質1種、酮類物質1種、其它物質5種，其風味物質有1-己醇、庚酸、辛酸等；Nong2當中檢測的物質包括：醇類2種、酯類22種、酸類1種、酮類物質1種、其他物質2種。Jiang當中物質種類包括：醇類6種、酯類24種、酸類2種、醛類3種、醚類1種、酮類1種、其他物質4種，苯己醇、3-戊酸乙酯、4-甲基戊酸等風味物質都是其中的檢測成分。Qing中所檢測到的風味物質包括：醇類2種、酯類8種、其他物質1種（不含酸類、醛類、酮類及醚類物質），具有香蕉香味的乙酸異戊酯是其特有檢測成分。在所有種類的酒樣中都檢測出酯類與醇類物質，由此可見酯類與醇類是對白酒風味貢獻最多的兩種揮發性風味物質。研究表明，酯類是具有芳香的化合物，主要貢獻水果香、花香和甜香，對形成風味特征起著重要的作用，醇類物質也是白酒重要的呈味助香物質，賦予白酒醇甜風味，與此同時作為酯類物質的前體，也賦予了酒體醇厚感和回味綿甜感[9]。酸類、醛類、酮類、醛類物質在醬香型、濃香型酒中種類屬占比相近，但經檢測，其所含揮發性風味物質的種類有很大差異。開放制曲和固態微生物菌群發酵兩項獨特的釀造工藝，以及白酒復雜的釀造環境，使白酒風味成分極其豐富。白酒風味成分種類多樣、成分復雜[25]。也正是由于這些微量物質的種類、含量不同，導致白酒在氣味、口味方面存在很大差異。在白酒發酵過程中，原料、釀造工藝、發酵劑、發酵設備等方面的差異，使其具有不同的香型和風格，各類白酒風格的形成也主要取決于所含的各類風味物質[24,26]。其中，濃香型白酒芳香濃郁、香味協調、綿柔甘洌、尾凈余長，己酸乙酯也是形成濃香型白酒典型風格的主體物質。醬香型白酒醬香突出，酒體醇厚，幽雅細致，色澤微黃，回味悠長，空杯留香持久，醬香型白酒中酯類物質種類豐富，醇類物質和有機酸總量較高。清香型白酒清香純正，自然諧調，醇甜柔和，余味爽凈，其主體香氣物質是乙酸乙酯，白酒的香型不同，風味各異。

圖2 不同香型白酒揮發性風味物質總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of flavor substances of different Baijiu

表1 不同香型白酒風味物質列表Table 1 List of different Baijiu flavor substances

續表 1

2.3 不同香型白酒的感官評價

根據10位感官評分員的評價分數繪制了感官評價雷達圖。

由圖3可知，4種白酒溶液的香氣特征各有不同，其中Nong1的谷香味和窖香味突出，Nong2的酸香味和酒香味較為濃郁。Jiang和Qing的果香味、甜香味及花香味的香氣屬性值非常相近。其中在GC-MS的檢測結果中，Nong1當中的酸類和酯類風味物質相對含量和種類較多，因此具有較為濃郁的窖酸味和谷香味，如檢測到的庚酸、辛酸和十四酸乙酯等風味成分。Nong2中特有的檢測成分正戊酸，具有奶酪的酸臭味。Jiang和Qing當中的乙酸乙酯和己酸乙酯相對含量相近，分別含有13.75%、12.87%和3.23%、0.36%，而乙酸乙酯和己酸乙酯均會帶來豐富的果香味。另外，Jiang當中所特有的苯乙醇能夠帶來濃郁的玫瑰花香味，且其所檢測到的苯甲酸乙酯和苯乙酸乙酯的相對含量也較高（相對含量為0.02%和0.10%），因此Jiang的花香味突出，Qing中具有香蕉香味的乙酸異戊酯是其特有檢測成分。總體來看，雖然不同白酒突出的香氣屬性值不同，存在一定的差異，但大部分結果與揮發性風味物質檢測結果一致。

圖3 感官評價雷達圖Fig.3 Sensory evaluation radar map

2.4 不同香型白酒的抗氧化活性對比分析

自由基清除劑能與DPPH·的孤電子配對，使DPPH溶液顏色褪去，同時在517 nm處的吸收峰漸漸降低，從而評價抗氧化能力的強弱[27]。此外乙醇在代謝過程中會產生許多羥自由基，人在飲酒時體內羥自由基的濃度會急劇升高[28]。若白酒含有有效清除羥自由基的活性物質，便能有效地抑制乙醇代謝過程中羥自由基的生成，保護機體免受氧自由基的損傷[29]。因此通過檢測白酒提取液清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力、清除ABTS自由基能力和清除超氧陰離子自由基能力的分析來探究不同香型白酒的抗氧化活性。

由表2可知，Nong1、Nong2、Jiang和Qing對DPPH自由基的清除率分別為41.87%、26.65%、36.86%和22.91%，對羥自由基的清除率分別為28.21%、46.98%、48.00%和31.93%，對ABTS自由基的清除率分別是23.75%、24.22%、31.50%和23.41%。超氧陰離子的清除能力的測定是利用鄰苯三酚自氧化法，Nong1、Nong2、Jiang和Qing對超氧陰離子的清除率分別為38.46%、7.21%、27.89%和17.20%。綜合4種抗氧化活性的實驗結果可以看出，3種香型白酒分別作用于不同的自由基，且都具有一定的抗氧化能力。這與之前研究報導適量飲酒對人體有一定抗氧化作用[30]，結論一致。之前研究發現吡嗪類、亞油酸乙酯、萜烯類化合物等都是白酒中的健康因子[17,31?32]，石亞林等[33]也提出不同香型白酒的抗氧化能力不同，并推測酚類化合物是引起白酒抗氧化活性的主要物質。豐富的活性物質和豐富的風味物質構成了中國白酒的復雜性，在這一認知的基礎之上，不斷解析中國白酒復雜構成給風味帶來的貢獻和價值，為不同白酒香型特點的發展提供方向。隨著研究的深入，越來越多的功能成分會被發現，從而可以更加科學地解釋“適量飲酒，利于健康”的道理。但是具體是因為哪些健康因子的不同，造成了不同香型白酒抗氧化作用特點的差異，這一問題還不太明晰，有待進一步研究。

表2 不同香型白酒對自由基抑制能力的顯著性分析（%）Table 2 Significance analysis of free radical inhibition ability of different flavor Baijiu (%)

3 結論

通過對不同香型白酒中風味物質成分的分析研究，微量風味物質成分分析方法采用HS-SPME-GCMS分析測定，Nong1中共檢出41種物質，Nong2中共檢出28種物質，Jiang中共檢出41種物質，Qing中共檢出11種突出的風味物質，并且在所有香型的白酒當中酯類與醇類都是對白酒風味貢獻最多的兩種揮發性風味物質。在感官評價結果中發現，Nong1具有較為濃郁的窖香味，Nong2酒香味突出，Jiang和Qing果香味香氣屬性值相近，Jiang的花香味香氣屬性值較高。3種不同香型白酒的風味物質種類和數量都具有其各自特點，口感及風味也有很大不同。

在抗氧化活性的實驗結果中表明，3種香型的白酒均具有一定的抗氧化作用，但其各自作用特點不同。其中Nong1對DPPH自由基和超氧陰離子的清除能力較強，Nong2和Jiang對羥自由基的清除能力基本一致，Qing對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基和超氧陰離子均有一定的清除能力，3種不同香型的白酒對ABTS自由基的清除能力相當。本文通過研究不同香型白酒的風味物質和抗氧化活性，探索不同香型白酒中微量物質的組成特點，以期能夠更深一步研究白酒中的“健康因子”及其作用機理，為白酒風味與健康雙導向的發展趨勢提供更為充分的參考依據，從而更好的指導生產，服務企業。