基于黑磷納米片的熒光適配體傳感器檢測雌激素17β-雌二醇

劉 曉，朱成龍，龐月紅，馮永巍，史學麗，張 毅,

（1.江南大學, 食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院，分析食品安全學研究所，江蘇無錫 214122；2.無錫市食品安全檢驗檢測中心，江蘇無錫 214122；3.石家莊市婦幼保健院，河北石家莊 050051）

環境雌激素（Environmental estrogens，EEs）是一種具有內分泌干擾效應的類固醇類物質，主要包括內源性雌激素（如雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮等）、外源性雌激素（如雙酚A、己烯雌酚等）以及其它具有內分泌干擾效應的化合物（如滴滴涕、多氯聯苯等）[1?2]。其中，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）具有較強的雌激素效應[3]，過量攝入會干擾機體的內分泌系統，引發生殖系統、免疫系統異常，甚至導致生殖器官癌變[4?5]。由于E2對動物體的生長發育具有促進作用而被應用于養殖業[6]，并隨動物排泄物進入土壤、水源中，導致肉類、乳類、蛋類以及環境中雌激素殘留問題日益嚴重。因此，監測食品中的E2對保障食品安全具有重要意義。

常用的E2檢測方法主要為色譜法[7?9]、免疫學方法[10]和適配體傳感法[11?12]。其中，適配體傳感器簡便、快速、特異性強、靈敏度高。適配體是通過體外指數富集的配體系統進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選得到的一段能夠與靶標特異性結合的單鏈DNA或RNA[13]。與抗體相比，適配體具有易于合成和修飾、穩定性高、適應范圍廣等優點[14?16]。

目前，熒光適配體傳感器已被應用于多種食品中污染物的檢測[12,17?19]。熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）原理是熒光傳感中常用的檢測原理，其實現條件有二，一是熒光供體的發射光譜與受體的吸收光譜存在重疊，二是供體和受體之間的距離小于一定程度（10 nm），當兩個條件都滿足時，供體-受體二者之間可以發生熒光共振能量轉移，從而利用供-受體距離變化導致的熒光強度變化反映分析物的含量[20]。常見的FRET供體有小分子熒光染料、量子點和上轉換納米材料等；受體有金納米粒子、氧化石墨烯和二硫化鉬納米片等[11,18，21?24]。

黑磷納米片（Black phosphorus nanosheets，BPNs）是從黑磷晶體中剝離出來的片層狀二維納米材料。它與石墨烯、石墨相氮化碳和二硫化鉬等其它二維材料有許多相似的屬性，如在紫外可見近紅外區都有較強的吸收、比表面積大等；同時還具有一些獨特的性能，如具有高載流子遷移率、高傳輸各向異性、層數依賴的帶隙和良好的生物相容性與生物安全性。在分析化學領域，BPNs最初被用在氣體和蒸汽傳感器，后來又被應用于檢測過氧化氫[25]、無機離子[26]、疾病標志物[27]和單鏈核酸[28]。與黑磷的另一種存在形態——黑磷量子點常作為FRET熒光供體的應用方式不同，BPNs自身并不發光但卻具有廣泛的吸收光譜，因此BPNs可以作為FRET熒光受體實現FRET過程[5,28]。與金納米粒子需通過巰基末端共價結合核酸的修飾方式不同，BPNs中的P原子可以通過范德華力將單鏈核酸吸附在其表面進而使標記在單鏈核酸上的熒光團淬滅，但它對雙鏈核酸和與靶標結合的適配體卻沒有吸附，故而無需修飾即可用于構建FRET體系。

因此，本文通過超聲輔助液相剝離法制備BPNs并將其作為FRET受體，以6-羧基熒光素（FAM）標記的E2適配體（FAM-Apt）作為FRET供體，構建熒光適配體傳感器，應用于E2的定量分析，并對其檢測性能和實際應用性能進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

17β-雌二醇適配體（5’-FAM-GCC-GTT-TGGGCC-CAA-GTT-CGG-C-3’） 生工生物工程（上海）股份有限公司；黑磷晶體 南京先豐納米材料科技有限公司；17β-雌二醇（E2）、雌三醇（E3）、雙酚A（BPA）、己烯雌酚（DS）、孕酮（P4） 上海阿拉丁生物技術有限公司；三羥基氨基甲烷（Tris）、氯化鈉（NaCl）、氯化鎂（MgCl2）、氯化鉀（KCl）、鹽酸（HCl）、乙醇（C2H5OH）、冰醋酸 分析純，北京國藥集團化學試劑有限公司；超純水 杭州娃哈哈集團有限公司；自來水 本實驗室；牛奶 本地超市。

Synergy H1多功能微孔板檢測儀 美國伯騰儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計、JEM-2100型透射電鏡 日本日立公司；UV-3600PLUS紫外-可見分光光度計 日本島津公司；ZEN3700型納米粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；3K30高速離心機

美國熱電公司；Scientz-IID型超聲波細胞破碎儀

寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-100DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；冷凍干燥機 北京博勱行儀器有限公司；BSA124S型電子天平 北京賽多利斯公司；渦旋振蕩器 德國艾卡公司；ST3100實驗室pH計 奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑磷納米片的制備與表征 采用超聲輔助液相剝離法制備黑磷納米片（BPNs）。稱取25 mg黑磷晶體（BP）于研缽中，加入少量水濕磨，然后轉移至50 mL離心管中加水約25 mL制成懸濁液，懸濁液經超聲波細胞破碎儀冰浴超聲10 h（超聲功率300 W，工作4 s停4 s）后，4000 r/min離心15 min，棄去未剝離的黑磷沉淀，上清液經真空冷凍干燥后得到尺寸較小的BPNs，將得到的BPNs配制成1 mg/mL的分散液備用。

所制備的BPNs使用紫外-可見分光光度計測定吸光度值（掃描范圍400～900 nm，采樣間隔0.5 nm，玻璃比色皿狹縫寬度2 mm，光程10 mm，規格0.7 mL）；取少量溶液稀釋超聲，吸取10 μL滴加至覆有碳膜的銅網上，干燥后采用JEM2110透射電鏡（工作電壓200 kV）進行表征；采用布魯克Dimension原子力顯微鏡（探針型號SCANASYST-AIR，掃描速率1.0 Hz，掃描像素256×256）進行片層厚度表征；采用納米粒度儀（以超純水作為溶劑，平衡時間120 s）測定水合粒徑[29]。

1.2.2 標準溶液的制備 使用乙醇溶液（分析純）分別配制1 mg/mL的17β-雌二醇、雌三醇、雙酚A、己烯雌酚、孕酮標準儲備液，不同濃度的標準溶液由1 mg/mL的儲備液稀釋得到，溶劑為Tris-HCl緩沖溶 液（100 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、25 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2，pH7.54）。6-羧基熒光素（FAM）標記的適配體4000 r/min離心1 min后，用超純水溶解至100 μmol/L備用。所有溶液置于?4 ℃保存。

1.2.3 檢測方法及條件優化

1.2.3.1 檢測原理 檢測原理如圖1所示，將FAMApt與BPNs混合后，FAM-Apt吸附在BPNs表面，二者發生熒光共振能量轉移，FAM的熒光被淬滅；當體系中存在E2時，E2與適配體特異性結合引起適配體構象改變，使FAM-Apt從BPNs表面脫離，FAM的熒光恢復，其恢復程度與目標物的濃度呈線性關系，據此可以實現對E2的定量分析。

1.2.3.2 檢測方法 取96孔黑色酶標板，分別加入50 μL FAM-Apt和50 μL BPNs，混合均勻后立即加入150 μL E2標準溶液或樣品溶液，混勻后室溫避光孵育一定時間，然后用多功能微孔板檢測儀測定熒光強度（Ex=490 nm，Em=520 nm），平行測定三次。以F0表示空白組（E2濃度為0 ng/mL）的熒光強度，F表示樣品溶液的熒光強度，傳感器的傳感信號用相對熒光強度（F/F0）表示。

1.2.3.3 條件優化 對BPNs濃度、FAM-Apt濃度和孵育時間進行優化。當FAM-Apt濃度為2.5 nmol/L時，考察不同BPNs濃度（5、10、15、20、40 μg/mL）反應20 min后傳感器對E2的響應。然后在不同FAM-Apt濃度（1.25、2.5、5、7.5、10 nmol/L）的反應體系中等比例加入對應濃度的BPNs（5、10、20、30、40 μg/mL），孵育20 min后測定熒光強度。在BPNs和FAM-Apt濃度分別為30 μg/mL和7.5 nmol/L的條件下，考察不同孵育時間（10、20、30、35、40、50、60 min）下傳感器對E2的響應。

1.2.4 特異性研究 96孔黑色酶標板中加入50 μL 37.5 nmol/L FAM-Apt，50 μL 50 μg/mL BPNs，再分別加入150 μL空白對照溶液，100 ng/mL E2標準溶液和E2結構類似物（雌三醇、雙酚A、己烯雌酚、孕酮）標準溶液，室溫下避光孵育30 min后測定熒光強度，平行測定三次。

1.2.5 實際樣品分析 為驗證本方法的準確性和對實際樣品的檢測能力，測定了自來水和市售牛奶樣品并進行了加標回收實驗。首先稱取2 g牛奶樣品，加入乙酸溶液調節pH至4.6以沉淀蛋白質，10 °C 7000 r/min離心10 min，取上清液備用。處理后的牛奶樣品和自來水分別按照1:20的體積比用緩沖溶液稀釋，然后加入不同濃度的E2標準溶液（0、4.5、30、60 ng/mL），按照1.2.3.2所述方法測定熒光強度，平行測定三次，外標法定量并計算加標回收率。

1.3 數據處理

使用Origin 2018對得到的吸光度值、熒光強度值、水合粒徑分布進行處理，并繪制紫外可見吸收光譜、熒光光譜和水合粒徑分布圖。使用NanoScope Analysis導入AFM圖，選取對應位置分析高度，并使用Origin 2018繪制對應位置高度圖。使用SPSS進行單因素顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 黑磷納米片的表征

超聲輔助液相剝離方法可以打破黑磷層間范德華力，將黑磷晶體剝離成少層甚至單層的黑磷納米（BPNs）。對所制備的BPNs進行表征，結果如圖2所示。透射電鏡（TEM）顯示該BPNs具有獨立的片層結構，大部分納米片都小于200 nm；由粒度儀獲得水合粒徑圖可以看出該BPNs尺寸分布較為均勻，水合粒徑平均值為310.3 nm；使用原子力顯微鏡（AFM）分析材料的厚度，結果表明該BPNs片層厚度約為4 nm，對應大約2～4層[29]；與黑磷晶體相比，BPNs在400～600 nm范圍內吸收明顯增強。以上表征結果共同證明由BP晶體成功剝離得到尺寸較小、層數較少的BPNs。

圖1 基于FRET原理測定17β-雌二醇（E2）的熒光適配體傳感示意圖Fig.1 Schematic illustration of fluorescence aptasensor for detection of 17β-estradiol (E2) based on FRET

圖2 BPNs的TEM圖（a），水合粒徑（b）以及BP和BPNs的吸收光譜（c）； BPNs的AFM圖（d）和圖（d）中對應位置的高度分析（e）Fig.2 The TEM image (a), hydrodynamic diameter distribution (b) of BPNs; the absorption spectrum of BP and BPNs (c);AFM image of BPNs (d) and corresponding height analysis of BPNs in figure (e)

2.2 E2檢測

2.2.1 可行性檢測 圖3（a）為BPNs的吸收光譜與FAM-Apt和E2的熒光發射光譜圖。BPNs的吸收范圍與FAM-Apt的發射范圍存在重疊；在FAMApt的熒光測試條件下，E2不會產生熒光信號干擾。因此，該體系滿足了FRET的第一個條件，即熒光供體的發射光譜與受體的吸收光譜存在重疊。以60 ng/mL E2進行熒光淬滅和恢復實驗，結果如圖3（b）所示。與FAM-Apt相比，加入BPNs后FAM的熒光被顯著淬滅，E2的加入使被淬滅的熒光有所恢復，證明FRET體系的可行性。

2.2.2 條件優化 BPNs濃度影響FAM的淬滅程度，進而影響檢測方法的靈敏度，因此BPNs的濃度對傳感器的構建有重要影響。如圖4（A）所示，隨著BPNs濃度增加，FAM-Apt的熒光強度逐漸降低。但當體系中BPNs的濃度過高時，與E2競爭結合適配體的程度大大增加，導致FAM-Apt與E2的結合不穩定，加入目標物后熒光恢復不明顯。以F/F0為縱坐標作圖可得，BPNs的濃度為10 μg/mL時熒光強度恢復最明顯。

適配體作為傳感器的識別元件對檢測方法的靈敏度具有重要影響，因此對FAM-Apt的濃度進行考察。由圖4（B）可以看出，隨著FAM-Apt度增加，響應信號逐漸增大，FAM-Apt濃度為7.5 nmol/L時熒光恢復強度最大，繼續增大FAM-Apt濃度后響應信號降低，可能是因為過高的FAM-Apt濃度導致傳感器對低濃度目標物響應不靈敏。因此，選擇7.5 nmol/L作為FAM-Apt的最終濃度。

圖3 不同條件下FAM-Apt熒光強度變化Fig.3 Fluorescence intensity of FAM-Apt under different conditions

圖4 BPNs濃度（A）、FAM-Apt濃度（B）和反應時間（C）對相對熒光強度的影響Fig.4 Effect of BPNs concentration (A), E2 aptamer concentration (B) and incubation time (C)on the relative fluorescence intensity

BPNs淬滅FAM需要一定的時間，適配體與目標物也需要一段時間才能完成結合過程，因此對反應時間進行了優化。結果如圖4（C）所示，隨著反應時間的增加，體系的熒光恢復強度逐漸增加，當反應時間達到30 min時相對熒光強度最大，此后稍有降低。因此，最終的反應時間確定為30 min。

2.3 標準曲線

在確定的最優條件下，將不同濃度（0～300 ng/mL）的E2標準溶液加入反應體系中，測定體系熒光恢復強度，以驗證本方法的靈敏度，確定線性范圍和檢測限。由圖5（a）可得，隨著E2濃度增加，熒光強度逐漸增強，當體系中E2濃度達到300 ng/mL時，熒光強度與E2濃度的關系偏離線性。以520 nm處的相對熒光強度（F/F0）對E2濃度作圖，結果如圖5（b）所示。從圖中可以看出，E2濃度在1.5～60 ng/mL的范圍內表現出良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.00987x+1.1458（R2=0.9845）。以3N/S（N指空白樣品信號標準偏差，S指標準曲線斜率）計算檢測限為1.0 ng/mL。以上結果表明，該方法具有良好的準確性和靈敏度。

圖5 不同濃度E2對傳感器的熒光響應Fig.5 Fluorescence intensity against different concentrations of E2

表1列舉了本方法與之前報道的其它E2檢測方法的比較結果。本實驗所述方法具有與納米金比色法相當的線性范圍和靈敏度，在滿足食品樣品檢測要求的前提下能夠在一定程度上避免納米金比色法和電化學方法抗干擾能力差的缺點。

2.4 特異性研究

為了驗證本方法對E2的選擇性，選擇E2的結構類似物雌三醇、雙酚A、己烯雌酚、孕酮進行特異性研究，E2和四種結構類似物的濃度均為60 ng/mL，測定結果如圖6所示。由于E2與適配體特異性結合，導致FAM-Apt從BPNs表面脫離，FAM-Apt熒光恢復；而結構類似物與適配體結合的親和力較低，加入反應體系后不能引起FAM-Apt從BPNs表面脫離，因此熒光恢復不明顯。以上結果表明，構建的基于適配體的熒光傳感器對E2具有良好的選擇性，可以實現對目標物的特異性檢測。

2.5 實際樣品分析

為了驗證本方法的準確性和在實際樣品中的應用能力，對自來水和牛奶樣品進行加標回收實驗。樣品中分別加入不同濃度(0、4.5、30、60 ng/mL)的E2，按本方法測定E2含量，回收率結果如表2所示。自來水和牛奶樣品的回收率分別為91.2%～104.8%和87.5%～104.3%，相對標準偏差(RSD)分別為4.99%～10.53%和4.48%～11.24%。以上結果表明，本方法可以應用于自來水和牛奶樣品中E2的檢測。

表1 不同17β-雌二醇檢測方法的比較Table 1 Comparison of different detection methods of 17β-estradiol

圖6 熒光適配體傳感器的選擇性實驗結果Fig.6 Specificity results of fluorescence aptasensor

表2 實際樣品中雌二醇加標回收實驗結果Table 2 Recovery results of 17β-estradiol in real samples (n=3)

3 結論

利用FAM標記的E2適配體作為熒光供體，BPNs作為熒光受體，基于FRET原理構建了熒光適配體傳感器用于E2的檢測。在最優實驗條件下，本方法在1.5～60 ng/mL的范圍內表現出良好的線性關系，檢測限為1.0 ng/mL，且檢測特異性、穩定性和重復性均良好，本方法可以實現雌二醇的快速靈敏檢測。自來水和牛奶樣品中加標回收實驗結果理想，表明該方法具有實際樣品檢測能力。與傳統的儀器檢測方法相比，本方法操作簡單，成本低，30 min即可完成檢測，在E2檢測方面具有良好的應用前景。