HS-SPME-GC-MS測定三種類型百香果果實揮發性風味成分

劉純友，江素珍，馮 笑，田玉紅,

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院食品科學與工程系，廣西柳州 545006；2.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢 430070）

百香果屬于西番蓮科西番蓮屬多年生藤本植物，是一種生長在熱帶、亞熱帶地區具有較高營養與藥用價值的藥食同源水果[1?2]。百香果又名西番蓮、雞蛋果，因果實成熟后散發出石榴、芒果、草莓、香蕉、菠蘿和檸檬等10余種水果的濃郁香味，故享有“百香果”的美譽。百香果原產于南美洲，廣泛分布于巴西、加勒比海、美國夏威夷、加利福尼亞、澳大利亞、南非、越南和中國等國家和地區[3]。我國主要分布在廣西、廣東、云南、福建、海南和臺灣等省區，其中以廣西壯族自治區百香果的品質為最佳。根據果實的形狀和果皮的顏色，廣西百香果可分為紫百香果、黃百香果和紅百香果（雜交果）三種類型。

揮發性風味成分是評價百香果品質的關鍵指標之一。在早期百香果揮發性風味成分研究中，采用有機溶劑萃取法[4]和水蒸氣蒸餾法[5]提取百香果香氣成分，但是有機溶劑萃取法消耗大量有機溶劑，污染環境，易給操作者帶來毒害；水蒸氣蒸餾提取溫度高，處理周期長，容易造成某些熱敏性風味成分的損失，并使百香果汁樣品長期處于高溫高濕的環境中，易使揮發性香氣成分的含量及其組成比例發生變化，未能客觀反映百香果汁揮發性風味成分的實際情況。Janzzantti等[6]采用動態頂空法對巴西黃百香果果汁中香氣成分進行提取，但該法需要專門化的吹掃捕集前處理裝置，價格昂貴。頂空固相微萃取（Solid Phase Micro-extraction，SPME）是一種不用有機溶劑的新型萃取技術，集采集、萃取、富集、進樣于一體，具有靈敏度高、操作簡單和綠色環保的特點。Mamede和Oliverira等[7?8]先用SPME對甜百香果果汁和百香果果酒中香氣成分進行提取，再通過質譜檢測分別鑒定出45種和25種揮發性成分。潘葳等[9]采用SPME-GC-MS對不同品種百香果果汁香氣成分進行比較分析，共鑒定出68種香氣成分。韓素芳等[10]優化了頂空固相微萃取提取百香果揮發性風味成分的前處理條件，但截止目前，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用結合相對氣味活度值對廣西壯族自治區不同類型百香果揮發性風味成分的研究未見相關文獻報道。

本研究選取廣西壯族自治區紫百香果、黃百香果和紅百香果為原料，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（HP-SPME-GC-MS）結合相對氣味活度值（ROVA）對廣西壯族自治區不同類型百香果揮發性風味物質進行測定與比較，旨在闡明不同百香果揮發性風味成分的組成特點，并為百香果的品種選育、風味改良及百香果加工產業高效持續發展提供有力技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的商業成熟度的三種類型百香果 即紫百香果（紫香1號）、黃百香果（華楊2號）和紅百香果（臺農1號），均產自廣西壯族自治區柳州市；氯化鈉分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

7890GC-5975MS氣相色譜-質譜聯用儀，色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、57330-U固相微萃取手柄 美國Supelco公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器 鞏義市予華儀器設備有限責任公司；FSH-2A高速勻漿機 常州越新儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 選取新鮮紫、黃和紅百香果三種類型，每種類型選取15個果，隨機分成3組。先將果實切半后取其肉囊，除去果籽后，再用高速勻漿機在6000 r/min轉速下進行勻漿處理3 min，然后置于0～5 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 萃取頭的老化 根據萃取頭生產商Supleco公司要求，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭置于氣相色譜的進樣口，在溫度270 ℃下老化60 min后備用[10]。

1.2.3 揮發性風味成分的萃取及解析 參照韓素芳等[10]方法，并做適當修改：取10 mL百香果漿于40 mL樣品瓶中加入氯化鈉，加蓋后立刻封口。在溫度50 ℃下平衡15 min，使之達到氣-液平衡。調節固相微萃取手柄，將老化好的固相為萃取頭插入樣品瓶的上端頂空部分，在溫度50 ℃下平衡15.0 min下萃取30 min，再將萃取頭拔出，插入氣相色譜-質譜聯用儀進樣口，于溫度230 ℃下解析5.0 min。樣品測試完畢，再將萃取頭在進樣口溫度230 ℃下解析10 min。

1.2.4 儀器分析條件及化合物定性定量 氣相條件：氦氣（純度>99.99%）為載氣，流速為1.0 mL/min，進樣模式為無分流進樣，進樣口溫度為230 ℃，解析時間：5.0 min；程序升溫條件：50 ℃保持2.5 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持0.5 min。質譜條件：離子源為EI源，離子源溫度為230 ℃，電離電壓70 eV，氣相色譜-質譜傳輸線溫度為280 ℃，掃描模式為Scan，掃描范圍為15～600 m/z。

定性與定量：利用NIST08譜庫的標準質譜圖對試驗得到的譜圖數據進行檢索與人工解析，選取匹配度大于80%作為物質鑒定依據[11]。采用面積歸一法對百香果中各揮發性風味化合物的相對含量（組分峰面積占總峰面積）進行定量[12]，試驗結果用百分數（%）表示。

1.2.5 主體揮發性風味成分評定方法 參照劉登勇和顧賽麒等[13?14]方法：采用相對氣味活度值（Relative Odor Activity Value，ROAV）評價各揮發性風味成分對百香果總體香氣的貢獻，同時定義對百香果總體風味貢獻最大的組分ROAVstan=100，那么其他揮發性組分組分的ROAV小于100，并按下式進行計算。

式中：Ci和Ti和分別表示揮發性組分i的相對含量（%）和感官閾值（μg/kg）；CStan和Tstan表示對樣品整體風味貢獻最大組分的相對含量（%）和感覺閾值（μg/kg）。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件對試驗數據進行統計分析，應用單因素方差分析法（one-way analysis of variance）對百香果中酯類、烯烴類、烷烴類、醇類和酮類等揮發性風味成分進行統計分析。檢驗水平設為P<0.05，每組試驗獨立重復3次，結果以平均值±標準偏差 (M±SD) 表示。

2 結果與分析

紫百香果、紅百香果和黃百香果三種果實揮發性風味成分的總離子流圖分別如圖1～圖3所示，各揮發性風味成分的定性定量結果如表1所示。研究發現，三種百香果果實中共鑒定出32種揮發性風味成分，其中酯類12種、烯烴類7種、烷烴類2種、醇類8種、酮類3種。

圖1 紫百香果揮發性風味成分總離子流圖Fig.1 Total ions chromatograms of volatile flavor compounds in purple passion fruit

圖2 紅百香果揮發性風味成分總離子流圖Fig.2 Total ions chromatograms of volatile flavor compounds in red passion fruit

圖3 黃百香果揮發性風味成分總離子流圖Fig.3 Total ions chromatograms of volatile flavor compounds in yellow passion fruit

2.1 三種類型百香果果實的主要揮發性風味成分

由表1和表2可知，紫百香果、紅百香果和黃百香果三種百香果果實的揮發性風味成分的組成種類及其含量存在差異。紫百香果果實中共檢測出23種揮發性風味成分，含量較高的成分為己酸己酯、丁酸乙酯、丁酸己酯、乙酸乙酯、（Z）-3-己烯-1-醇-乙酸酯、己酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、（E）-丁酸-3-己烯基酯。紅百香果中共檢測出23種揮發性風味成分，含量較高的成分為己酸己酯、丁酸己酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸己酯、（Z）-3-己烯-1-醇-乙酸酯、（Z）-3-己烯-1-醇-乙酸酯。黃百香果中共檢測出23種揮發性風味成分，其中主要成分為丁酸乙酯、己酸己酯、鄰苯二甲酸二丁酯、β-月桂烯、己酸乙酯、丁酸己酯、1-正己醇、乙酸乙酯。

研究發現，三種百香果果實中檢測出16種共有成分：乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、（Z）-3-己烯-1-醇-乙酸酯、鄰苯二甲酸二丁酯、丁酸己酯、己酸己酯、β-月桂烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯、1-十八烯、1-正己醇、芳樟醇、松油醇、β-紫羅蘭酮，但它們在三種百香果中的相對含量有所差異，這些化合物可能是百香果的關鍵香味物質。此外，紫百香果果實中檢測到4種特有成分：2-甲基丁酸甲酯、α-水芹烯、苯甲醇、（Z）-1-辛烯-3-醇。3-蒈烯、十四烷、2, 3-辛二酮這3種成分僅在紅百香果果實中檢測到，黃百香果果實中檢測到3種特有成分：二氫-β-紫羅蘭醇、正己烷、乙醇。

表1 三種類型百香果果實的揮發性風味成分Table 1 Volatile flavor compounds in three passion fruit species

表2 三種類型百香果果實中揮發性化合物的種類及其相對含量Table 2 Categories and relative contents of volatile flavor compounds in three passion fruit species

2.2 三種類型百香果果實的揮發性風味成分的比較

2.2.1 酯類化合物的比較和分析 結果表明，酯類化合物是構成三種百香果揮發性風味成分的主要組分。由表2可知，紫百香果、紅百香果和黃百香果分別鑒定出酯類化合物11種、11種和9種，酯類化合物是三種百香果果實中含量最高的揮發性風味成分，分別占紫百香果、紅百香果和黃百香果總體揮發風味成分含量的99.23%、99.26%和99.77%。三種百香果中酯類化合物存在顯著差異（P<0.05），其中紅百香果含量最高、其次是紫百香果，而黃百香果最低。己酸己酯、丁酸乙酯、丁酸己酯、乙酸乙酯是構成三種果實中酯類化合物的主要成分，其中以己酸己酯含量最高，紫百香果、紅百香果和黃百香果分別為20.41%、25.58%和18.80%。

2.2.2 烯烴和烷烴類化合物的比較和分析 烴類化合物是構成三種百香果香氣的重要成分之一。烴類化合物包括烯烴類和烷烴類兩類，三種果實中烯烴類化合物含量（1.95%～10.19%）顯著高于烷烴類化合物（0.23%～1.06%），且兩者明顯低于酯類化合物（58.87%～93.94%）。三種百香果中鑒定出烯烴類化合物7種，其中共有成分4種，即β-月桂烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯和1-十八烯。萜品油烯為黃百香果特有，3-蒈烯僅在紅百香果中檢出，α-水芹烯為紫百香果特有（表1）。烷烴類化合物在三種百香果中含量均較低，其中正己烷僅發現于黃百香果，而十四烷僅在紅百香果中檢出。

2.2.3 醇類化合物的比較和分析 由表2可知，三種果實中鑒定出醇類化合物8種，黃百香果中醇類化合物種類最多，為6種，其次是紫百香果為5種，而紅百香果最少，僅有4種。由表1可知，三種百香果中共有成分3種，即1-正己醇、芳樟醇和松油醇。紫百香果特有的醇類化合物有兩種，即（Z）-1-辛烯-3-醇和苯甲醇；黃百香果中特有的醇類化合物也有兩種，即乙醇和二氫-β-紫羅蘭醇。

2.2.4 酮類化合物的比較和分析 研究發現，三種果實中紫百香果、紅百香果和黃百香果分別占總量的1.92%、1.97%和2.25%（表2），其中β-紫羅蘭酮為三種果實共有，且它是含量最高的酮類，分別占三種果實酮類化合物的80.73%、84.77%和40.00%。此外，二氫-β-紫羅蘭酮為紫百香果和黃百香果共有，而2, 3-辛二酮為紅百香果所特有。酮類化合物雖然在三種果實中種類和含量很少，但因酮類化合物的感覺閾值較低，因此它對百香果香氣有較大貢獻。

2.3 三種類型百香果果實中揮發性成分的相對氣味活度值分析

由于百香果樣品中包含30余種揮發性成分，如何從幾十種揮發性成分中篩選出若干關鍵揮發性成分是本研究的重點。研究表明，相對氣味活度值（ROVA值）是一種確定食品關鍵風味化合物的一種新的有效方法[13]。根據食品風味化學，當化合物的濃度一定時，感覺閾值越低的化合物越容易被人體感知[14]，說明該化合物對食品總體風味貢獻值越大。定義對樣品總體風味貢獻率最大的組分ROVAstan=100[14]，那么所有組分ROVA≤100。通常認為ROVA≥1的組分為樣品的關鍵風味物質，并且在某一范圍內，ROVA越大說明該組分對總體貢獻越大；0.1≤ROVA≤1的組分對樣品總體風味起重要修飾作用[15?16]。通常認為，揮發性化合物對百香果香氣的貢獻由其含量和感官閾值共同決定，某些含量高且感覺閾值高的組分不一定對總體風味起重要作用；相反，某些組分含量較低且感覺閾值低的組分可能對總體風味發揮關鍵作用。

按照公式（1）計算三種百香果中各揮發性風味成分的ROVA值，如表3所示。根據揮發性成分的ROVA值大小，紫百香果中關鍵揮發性風味成分（ROVA≥1）有4種，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯和β-紫羅蘭酮；起重要修飾作用的揮發性風味成分（0.1≤ROVA≤1）有5種，分別為辛酸乙酯、丁酸己酯、β-月桂烯、1-辛烯-3-醇和芳樟醇。根據ROVA值大小，紅百香果中關鍵揮發性風味成分（ROVA≥1）有4種，與紫百香果基本一致，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯和β-紫羅蘭酮；起修飾作用的揮發性風味成分（0.1≤ROVA≤1）有5種，分別為丁酸己酯、乙酸己酯、芳樟醇、β-月桂烯和辛酸乙酯。根據ROVA值大小，黃百香果中關鍵揮發性風味成分（ROVA≥1）有5種，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、芳樟醇和β-紫羅蘭酮；起修飾作用的揮發性風味成分（0.1≤ROVA≤1）也有5種，分別為辛酸乙酯、乙酸己酯、D-檸檬烯、β-月桂烯和丁酸己酯。D-檸檬烯是柑橘類果實中重要的香氣物質之一，并對柑橘果汁的風味有重要貢獻[26]。此外，由于部分揮發性風味成分未能查詢到其對應的感官閾值未做相應分析。

3 討論與結論

不同揮發性化合物由于在樣品中含量和感官閾值的不同，其對果實香氣的貢獻率存在較大差異，僅通過某種揮發性成分含量的高低不能準確判斷其對果實香氣貢獻的大小，只有較高的ROVA值或氣味活度值（odor activity value, OAV=嗅感物質的絕對濃度（C）/其感覺閾值（T））的組分才是果實的特征香氣[30]。

酯類是百香果揮發性風味成分中最重要的香氣成分之一。Mamede等[31]從巴西甜百香果的揮發性香氣成分中鑒定出45種化合物，酯類和烯烴類是甜百香果揮發性風味的主要成分，主要包括丁酸甲酯、（E）-2丁酸甲酯、丁酸乙酯、（E）-2丁酸乙酯和己酸乙酯等，其中丁酸乙酯和己酸乙酯對甜百香果風味起關鍵作用。飽和、不飽和酯類化合物（含2～8個碳）在百香果中含量尤為豐富，乙酸丁酯、丁酸丁酯、己酸丁酯和乙酸己酯，特別丁酸乙酯和己酸乙酯對黃百香果的典型香氣發揮重要作用[32?33]，這些酯類物質主要是脂肪酸（含2～8個碳）在酰基輔酶A作用下通過β-氧化作用與醇類發生酯化反應，生成脂肪族酯類化合物[34]。在本研究中廣西紫、紅和黃百香果中均檢測到乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯，且化合物乙酸乙酯（4.66%～8.05%）、丁酸乙酯（10.83%～15.95%）和己酸乙酯（6.48%～12.84%）的相對含量高，而且丁酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯的感覺閾值分別為0.76、1.20 μg/kg和5.0 μg/kg，由于三者的感覺閾值較低，故三者是對三種百香果的特征風味起關鍵作用的酯類化合物。此外，本研究雖然在三種百香果中均檢測到較高相對含量的己酸己酯（18.80%～25.58%）和丁酸己酯（4.89%～15.03%），且在紅百香果（6.10%）和黃百香果（7.75%）中發現較高相對含量的乙酸己酯，但己酸己酯在紫、紅和黃百香果中ROVA值分別為0.05、0.09和0.03（ROVA<0.1），這表明己酸己酯對百香果總體風味有一定修飾作用。丁酸己酯在紫、紅和黃百香果中ROVA值分別為0.47、0.42和0.10（0.1≤ROVA≤1），這說明丁酸己酯對三種類型百香果起重要修飾作用。乙酸己酯在紅、黃百香果中ROVA值分別為0.37和0.33，這說明丁酸己酯對紅和黃百香果起重要修飾作用，但丁酸己酯對紫百香果沒有重要修飾作用。

表3 三種類型百香果中揮發性化合物及其相對氣味活度值Table 3 ROVA of volatile flavor compounds in three passion fruit species

烯烴類化合物是百香果重要的香氣物質之一。Braga等[35]采用HS-SPME-GC-MS從巴西黃百香果中鑒定出β-羅勒烯（6.25%）、檸檬烯（1.19%）、萜品油烯（1.46%）、β-蒎烯（2.32%）等八種烯烴類化合物，袁源等[18]采用HS-SPME-GC-MS結合保留指數法從紫百香果中僅鑒定出β-羅勒烯（0.49%）和月桂烯（0.35%）兩種烯烴類化合物。本研究中紫、紅和黃百香果中均檢測到β-月桂烯（0.34%～0.70%）、檸檬烯（0.20%～3.44%）、β-羅勒烯（0.43%～2.73%）和1-十八碳烯（0.56%～1.82%），其中β-月桂烯和檸檬烯對百香果的特征香氣具有重要修飾作用，檸檬烯是柑橘類果實的特征香氣化合物，具有典型的柑橘香氣[36]。

酮類和醇類是重要的香氣化合物，β-紫羅蘭酮、松油醇、芳樟醇和1-正己醇是三種百香果中含量較高的酮類和醇類化合物。由于β-紫羅蘭酮具有較低的感覺閾值（3.5 μg/kg）且它們在三種百香果中的相對含量較高，β-紫羅蘭酮在紫、紅、黃百香果中的相對氣味活度值（ROVA≥1）分別為2.16、3.35和2.08（表3），所以β-紫羅蘭酮是三種百香果的關鍵特征風味成分；同時，由于黃百香果中芳樟醇的相對氣味活度值為2.20（ROVA≥1），故芳樟醇是構成黃百香果的關鍵特征風味；而紫百香果和紅百香果中芳樟醇的相對氣味活度值分別為0.44和0.32（0.1≤ROVA≤1），故芳樟醇對紫百香果和紅百香果的特征香氣發揮重要修飾作用。Natali和Oliveira等[17,37]研究發現1-正己醇是構成黃百香果香氣組分中醇類化合物的重要組分。由于1-正己醇在紫、黃和紅百香果中的ROVA值分別為0.011、0.046和小于0.01，故1-正己醇對三種類型百香果特征風味的貢獻值較小。松油醇在紫、黃和紅百香果中的ROVA值分別為0.016、0.013和0.07（ROVA<0.1），所以松油醇對百香果特征香氣沒有重要修飾作用。同理，1-辛醇在紅、黃百香果中的ROVA值分別為0.05和0.06（ROVA<0.1），故1-辛醇對紅、黃百香果總體特征風味的貢獻值不大。

本研究先采用頂空固相微萃取提取紫百香果、紅百香果和黃百香果果實的揮發性風味成分，再經氣相色譜-質譜聯用結合相對氣味活度值共鑒定出32種揮發性風味成分，其中紫、紅百香果23種和黃百香果22種。不同類型百香果揮發性風味成分的種類和含量差異較大，紫、紅百香果中關鍵揮發性風味成分（ROAV≥1.0）有4種，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯和β-紫羅蘭酮，而黃百香果中關鍵揮發性風味成分（ROAV≥1.0）有5種，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、芳樟醇和β-紫羅蘭酮；同時，百香果中還存在一些對百香果特征香氣起重要修飾作用的揮發性風味成分（0.1≤ROVA≤1），如辛酸乙酯、乙酸己酯、丁酸己酯、β-月桂烯、D-檸檬烯等，這些關鍵風味成分和重要修飾成分共同構成了百香果的特征香氣。