滅菌和貯藏溫度對荔枝汁中多酚化合物組成、含量及其抗氧化活性的影響

王 丹，王智能,，董麗紅，舒 彬,，王俊敏,，蘇東曉，吳光旭,4,

（1.長江大學生命科學學院, 湖北荊州434020；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東廣州510610；3.廣州大學化學化工學院，廣東廣州510610；4.長江大學荊楚特色食品研發中心，湖北荊州434000）

荔枝是一種熱帶及亞熱帶水果，在世界各地都有栽培，特別是在中國、越南、泰國、美國等國種植較多，是世界上許多國家的經濟作物[1?2]。已有研究表明荔枝果肉中含有大量的酚類化合物，其中原花青素、沒食子兒茶素、表兒茶素含量分別高達89.32、87.09和31.15 mg/g[3]。酚類化合物是植物的次生代謝產物[4?5]，槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷、表兒茶素和蘆丁是荔枝果肉中的主要酚類化合物[6?8]。除此之外，酚類物質也是最活躍的抗氧化衍生物，這不僅是它們具有提供氫或電子的能力，還因為它們具有穩定的自由基中間體[9]。荔枝果肉中的酚類化合物具有抗氧化、抗炎和降血脂的作用[10?11]。

荔枝果實是在六月至八月的炎熱雨季采摘的，不耐貯藏，易受微生物的影響而腐爛[12]，荔枝果肉可制成荔枝汁，不僅保留荔枝原有香味，而且保質期長，具有市場潛力。熱處理在食品工業中得到了廣泛的應用，其在酶的滅活和防止微生物繁殖變質方面具有很好的效果[13?14]。經過熱處理的水果和蔬菜由于熱處理過程中的各種化學變化，其生物活性顯著提高，Alongi等[15]報道了生蘋果汁經巴氏殺菌后，總酚濃度從5.33 mg/L增加到32.66 mg/L，鄧俊琳等[16]研究表明，與冷凍干燥相比，熱風干燥處理的余甘子樣品多酚化合物含量和總多酚含量更高，抗氧化活性更強。荔枝汁經不同滅菌方式（70 ℃巴氏殺菌或121 ℃高溫滅菌）和不同溫度貯藏（4 ℃或 45 ℃）后，其酚類特性和抗氧化活性的變化鮮見報道。

本研究的目的是探究不同熱處理溫度和不同貯藏溫度對荔枝汁中酚類物質含量和組成及抗氧化活性的影響，并為荔枝汁加工工藝提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用荔枝品種為俊紅 2018年7月從廣州天平架水果批發市場采購所得；沒食子酸、沒食子兒茶素、香草酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、阿魏酸、蘆丁 上海源業生物科技有限公司；槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷 實驗室自制[6]；鐵離子抗氧化能力（Ferric Reducing Ability of Plasma，FRAP）試劑盒 南京建城生物工程研究所；福林酚試劑、熒光素二鈉鹽（FL）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH） 美國Sigma-Aldrich公司；乙酸、乙腈色譜純，中國賽默飛世爾公司。

TD6型冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津公司；HPLC-1260型高效液相色譜儀 美國AgiLent 公司；LS-75HD型立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；X5型水浴鍋 瑞士SaLvis 公司；Infinite M200pro型酶標儀 奧地利TECAN公司；Ultra Scan VIS型色度儀 美國Hunter Lab公司；gzx-9420 MBE型恒溫電熱空氣干燥器 中國上海Boxun工業有限公司；DW-86L486超低溫冰箱 中國海爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 俊紅荔枝汁的制備 新鮮荔枝用自來水沖洗，手動去皮和去核，將果肉進行榨汁處理。以4000 r/min離心5 min，取上清液得到荔枝汁樣品。每30 mL荔枝汁置于玻璃容器中，分別做如下處理：荔枝原汁作為對照，70 ℃巴氏殺菌即70 ℃熱水浴30 min，121 ℃高溫滅菌為在121 ℃蒸汽滅菌鍋中熱處理30 min。然后，將荔枝汁分為兩組：一組在低溫（4 ℃）下冷藏0、24、72、120和168 h，另一組，按Rao等[17]所報道的加速貯藏，在45 ℃條件下儲存0、6、24、48和72 h。所有試驗樣品在指定時間內取出并分裝儲存于?80 ℃冰箱中進行下一步分析。

1.2.2 總酚和總黃酮含量的測定 總酚和總黃酮含量測定的方法參照Su等[18]的方法?？偡雍涂傸S酮含量分別以沒食子酸和蘆丁作為標準，以每百毫升荔枝汁中沒食子酸和蘆丁含量當量表示?？偡訕藴是€回歸方程為y=0.0017x+0.0249，決定系數R2=0.9996，總酚含量在40～400 μg/mL范圍內線性關系良好。總黃酮標準曲線回歸方程為y=0.0011x?0.0007，決定系數R2=0.9997，總黃酮含量在50～500 μg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.3 FRAP抗氧化能力的測定 FRAP抗氧化能力的測試依據試劑盒上的操作說明進行，以硫酸亞鐵作為標品繪制標準曲線，計算各樣品的FRAP抗氧化能力值。得到線性回歸方程：y=0.255x?0.0083，決定系數R2=0.9999，當FeSO4在所用體系中濃度為0.15～1.5 μmol/L時，與其線性關系良好。

1.2.4 ORAC抗氧化能力的測定 ORAC抗氧化能力的測定參考Su等[6]報道，并稍作修改。荔枝汁用75 mmol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）稀釋備用，黑色96孔板的每個孔中加20 μL荔枝汁或Trolox標準溶液（6.25～50 μL）或標品對照（標品對照為0.11 mg/mL沒食子酸）。將96孔板置于酶標儀上孵育10 min后加入200 μL熒光素，再孵育20 min。然后加入20 μL AAPH溶液（119 mmol/L）。熒光測定條件如下：激發波長485 nm，發射波長538 nm，連續測定各孔的熒光強度監測熒光衰退情況，每4.5 min重復一次，測定35個循環。ORAC抗氧化能力值以每百毫升中所含Trolox當量表示。

1.2.5 荔枝汁中單體酚類物質含量及組成的測定根據Zhang[19]的方法稍作修改，采用反相高效液相色譜法對荔枝汁中的酚類化合物進行鑒定。采用YMC-Pack ODS-A柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；DAD檢測器；流動相流速1.0 mL/min下進行高效液相色譜分析。流動相為溶劑A（水/乙酸，996:4）和溶劑B（乙腈）。以下為洗脫梯度：0～40 min溶劑B：5%～25%；40～45 min溶劑B：25%～35%；45～50 min溶劑B：35%～55%；總運行50 min，平衡5 min。

1.3 統計分析

所有試驗均平行測定3次，結果以平均值±標準差（M±SD）表示。采用SPSS 19軟件進行單因素方差分析，并以SNK檢驗比較各組間顯著性差異，顯著性水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 熱處理和貯藏溫度對荔枝汁總酚含量的影響

圖1 不同熱處理溫度和不同貯藏溫度對荔枝汁總酚含量的影響Fig.1 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on the total phenolic content of lychee juice

俊紅荔枝汁在滅菌處理和貯藏條件下，其總酚含量的變化如圖1所示。在0 h，巴氏殺菌和高溫滅菌荔枝汁與荔枝原汁相比，其總酚含量分別增加了5.32%和62.02%。高溫滅菌荔枝汁的總酚含量與巴氏殺菌的相比增加了53.84%。Alongi等[15]報道，蘋果汁經90 ℃處理14.8 min后，總酚含量提高到原蘋果汁的6倍?？偡雍康脑黾涌赡苁怯捎跓崽幚硎苟喾友趸甘Щ钜约安荒蜔峄衔锏臒嵴T導水解釋放單體和二聚體，酶催化活性被破壞，酚類化合物無法聚合，阻止了酚類化合物參與褐變反應[15,19]；另一方面高溫促進植物組織細胞破碎和共價鍵的斷裂，促進更多酚類物質的釋放[16]。因此，熱處理能促進荔枝汁中酚類物質的釋放，且其釋放量隨熱處理溫度的升高而增加。荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁在4 ℃條件下貯藏168 h后，其總酚含量顯著降低（P<0.05），與徐涓等[20]研究報道未處理的余甘子果汁和經高溫處理的余甘子果汁在4 ℃條件下貯藏7 d，總酚含量均顯著降低結果一致，酚類物質質量濃度減少可能是其氧化聚合和多酚氧化酶的酶促反應導致；而在45 ℃條件下貯藏72 h后，其總酚含量與它們0 h的總酚含量相比分別增加了37.79%和40.27%，這種差異主要是由于沒食子酸含量的增加[18]。高溫滅菌荔枝汁中總酚含量的變化與它們不同，4 ℃貯藏期間其總酚含量未見顯著降低（P>0.05），這是因為高溫蒸汽處理可鈍化多酚氧化酶，從而抑制多酚化合物的氧化[20]；而45 ℃貯藏條件下其總酚含量顯著降低（P<0.05），與高溫滅菌0 h相比降低了18.23%，這與曾慶帥[21]的研究結果一致；高溫滅菌荔枝汁45 ℃貯藏條件下其總酚含量降低的原因可能為，高溫貯藏過程中，食物基質中發生多種化學反應，而酚類化合物的降解與化學反應的類型有關[22]。因此，4 ℃和45 ℃貯藏溫度對于荔枝汁中總酚含量的變化具有顯著影響（P<0.05）。

2.2 熱處理和貯藏溫度對荔枝汁總黃酮含量的影響

圖2 不同溫度熱處理和不同貯藏溫度對荔枝汁總黃酮含量的影響Fig.2 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on the total flavonoid content of lychee juice

在熱處理過程中，俊紅荔枝汁中總黃酮含量的變化與其總酚含量的變化相一致（圖2）。經121 ℃高溫滅菌后立即測定其總黃酮含量，并與0 h的荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁相比，分別增加了17.36%和16.86%。研究表明，在90 ℃熱處理后，果汁-大豆飲料的總黃酮含量增加了61.54%[22]，熱處理對酚酸和黃酮物質的釋放具有促進作用。但在4 ℃和45 ℃貯藏期間，荔枝汁中總黃酮含量的變化與其總酚含量的變化不一致。荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁中的總黃酮含量在4 ℃和45 ℃貯藏期間均未顯著降低（P>0.05）。與Dos等[23]報道，新鮮橙汁經88 ℃熱處理后，8 ℃貯藏15 d后，其總黃酮含量未見顯著下降結果一致。而高溫滅菌荔枝汁中的總黃酮含量在45 ℃貯藏期間，隨貯藏時間的延長而顯著降低（P<0.05），72 h后降為最低值42.96 mg RE/100 mL，與高溫滅菌0 h相比降低了41.32%。研究表明長時間加熱可使黃酮含量降低，損失程度取決于化合物的化學結構和孵育時間[24]。該條件下黃酮含量降低原因可能是由于荔枝汁經高溫滅菌處理后生成的黃酮類物質，在45 ℃高溫貯藏條件下不能穩定存在，該物質易發生降解。因此，結果表明，45 ℃高溫貯藏條件對于荔枝汁中總黃酮含量的變化具有顯著影響（P<0.05），俊紅荔枝汁中的總黃酮含量在4 ℃低溫貯藏條件下能穩定存在，不易降解。

2.3 熱處理和貯藏溫度對荔枝汁中總抗氧化能力的影響

用FRAP法測定了俊紅荔枝汁的抗氧化活性（圖3），結果表明俊紅荔枝汁經121 ℃高溫滅菌后其FRAP抗氧化能力與0 h的荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁相比顯著增強（P<0.05），其結果與總酚含量測定的結果相一致，這是由于，熱處理可能破壞細胞壁，從荔枝汁中不溶性部分釋放抗氧化化合物或者釋放了結合態酚，可能是加熱改變了與酚相結合的蛋白質，導致酚含量的增加，或加熱水解單寧分解為小分子的酚，這些反應產物具有不同抗氧化能力[25]。在4 ℃貯藏168 h后，荔枝原汁、巴氏殺菌和高溫滅菌荔枝汁中的FRAP抗氧化能力與0 h的荔枝汁相比均降低，這與何禮等[26]研究結果有差異，可能是因為貯藏時間以及原料品種不同，在何禮等的研究中FRAP抗氧化能力隨貯藏時間延長波動較大。荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁在45 ℃條件下貯藏72 h后，其抗氧化能力增強，而高溫滅菌荔枝汁則顯著降低 (P<0.05)，且與荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁中的FRAP抗氧化能力相比無顯著性差異（P>0.05）。高溫滅菌會增加荔枝汁的抗氧化能力。

圖3 不同溫度熱處理和不同貯藏溫度對荔枝汁總抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on the total flavonoid content of lychee juice

2.4 熱處理和貯藏溫度對荔枝汁中ORAC抗氧化能力的影響

采用ORAC抗氧化法對俊紅荔枝汁中抗氧化活性測定的結果如圖4所示?？〖t荔枝汁經121 ℃高溫滅菌后其ORAC抗氧化能力與0 h的荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁相比分別增加了40.24%和39%，這一結果與其總酚含量和FRAP抗氧化能力測定的結果相一致。據報道，在高溫滅菌3 min后，綠蘆筍汁的抗氧化能力約為新鮮蘆筍的1.68倍[27]。在4 ℃貯藏168 h后，荔枝原汁、巴氏殺菌和高溫滅菌荔枝汁中的抗氧化能力與0 h的相比均顯著降低。在45 ℃條件下貯藏72 h后，荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁中的抗氧化活性與0 h的荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁相比都增加，而高溫滅菌荔枝汁則顯著降低（P<0.05）。以上結果與FRAP分析結果一致，進一步說明熱處理和高溫貯藏可以促進酚類物質的釋放，提高其抗氧化活性。

圖4 不同溫度熱處理和不同貯藏溫度對荔枝汁ORAC的影響Fig.4 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on ORAC of different varieties of lychee juice

2.5 熱處理和貯藏溫度對荔枝汁中酚類化合物的含量及組成的影響

采用HPLC-DAD檢測出俊紅荔枝汁中含有11種酚類化合物：沒食子酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、表兒茶素、沒食子兒茶素、槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷、蘆丁、原花青素B2和原花青素A2（圖5）。根據圖5計算出各物質的含量如表1所示。在0 h，巴氏殺菌荔枝汁與荔枝原汁相比，丁香酸、表兒茶素、槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷、原花青素B2的含量增加，阿魏酸和咖啡酸的含量降低，說明酚類化合物之間的轉化受熱處理的影響[28]。在0 h，高溫滅菌荔枝汁中的沒食子酸含量與荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁相比顯著增加（P<0.05），槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷和阿魏酸的含量則顯著降低（P<0.05），除此之外沒食子兒茶素被生成，其含量約占121 ℃高溫滅菌荔枝汁中總酚類化合物含量的91.74%。沒食子兒茶素是兒茶素類化合物中8種單體中的一種，表兒茶素或原花青素均能與沒食子酸發生酯化反應生成沒食子兒茶素[29]。除此之外，高溫滅菌荔枝汁中表兒茶素完全降解。有研究表明灌裝和瓶裝的茶飲料經120 ℃高壓滅菌后，在運輸和銷售的過程中，飲料中低濃度的表兒茶素會被轉化成相應的差向異構體，其中包括沒食子兒茶素，而這些差向異構體的含量與表兒茶素相似或更高[30]。因此，表兒茶素的降解可能是沒食子兒茶素大量生成的主要原因；此外，121 ℃高溫會促進荔枝汁中沒食子兒茶素的釋放。在4 ℃貯藏168 h后，荔枝汁中總酚含量與0 h相比均降低，這與其總酚含量、總黃酮含量和抗氧化活性的結果相一致。在45 ℃貯藏72 h后，俊紅荔枝汁中酚類化合物的含量及其組成發生顯著變化，主要表現為其中荔枝原汁和巴氏殺菌荔枝汁中沒食子酸含量顯著增加（P<0.05），高溫滅菌荔枝汁中沒食子兒茶素完全降解。沒食子兒茶素發生消失，是因為在持續的高溫貯藏條件下，熱分解導致生物活性化合物的損失[18]。除此之外，荔枝汁為酸性環境，兒茶素類在酸性環境中多不穩定，特別是在高溫酸性的環境下，隨貯藏時間的延長易發生降解[4]。由表1可知，高溫滅菌荔枝汁中均未檢出表兒茶素，Lee等[31]研究表明，隨著溫度和時間的增加，表兒茶素類物質減少，表兒茶素差向異構體增加，高溫滅菌荔枝汁均未檢出表兒茶素，可能是因為熱處理誘導共價結合兒茶素的釋放和兒茶素的異構化。

圖5 高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography

表1 熱處理和貯藏溫度對荔枝汁中酚類物質含量及組成的影響Table 1 Effects of heat treatment and storage temperature on content and composition of phenolic in lychee juice

3 結論

熱處理和貯藏溫度對俊紅荔枝汁中酚類特性和抗氧化活性具有顯著影響。70 ℃巴氏殺菌和121 ℃高溫滅菌均可促進荔枝汁中酚類化合物的釋放，121 ℃高溫滅菌荔枝之中總酚含量更高。4 ℃低溫貯藏，荔枝汁中酚類物質的含量降低，但其酚類物質組成的變化較小。45 ℃高溫貯藏，對于荔枝汁中酚類物質的含量及其組成均具有顯著影響。因此選取121 ℃作為荔枝汁的滅菌溫度，4 ℃作為荔枝汁的短期貯藏溫度。本研究提出的荔枝汁的滅菌和貯藏溫度能提高荔枝汁中酚類物質的含量及抗氧化活性，為荔枝汁的加工及貯藏提供了較好的理論基礎，為生產荔枝汁產品提供便利。