黑豆多肽對超負荷訓練小鼠肝細胞損傷影響的研究

賈前生，劉遠洋

（1.黑龍江八一農墾大學體育教研部，黑龍江大慶 163000；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163000）

超負荷運動訓練在競技體育運動員的日常訓練中必不可少，但不適宜的超負荷運動會導致機體出現嚴重的過度訓練綜合征，它在競技體育運動員中是一種常見的運動性勞損，運動員為提高運動成績采用“超負荷訓練”后，若沒有及時的休息與恢復就會引發該癥狀[1?2]。研究表明運動的強度與肝細胞的凋亡有著密切聯系，高強度運動會使肝細胞缺氧，抗氧化物酶逐漸消耗、活性降低，致使機體無法完全代謝氧自由基，進而肝臟氧自由基水平升高[2]，而自由基的蓄積會使肝細胞結構異常、細胞膜通透性提高、內容物溢出等[3?4]。肝臟是機體重要的代謝、排毒器官，大多數物質需要經過肝臟代謝才能通過循環系統排出體外。肝臟受到損傷時會誘發肝細胞凋亡、壞死等特征的疾病，其機理主要來源于自由基生物學理論與線粒體損傷、自由基脂質過氧化、炎癥細胞因子分泌和細胞膜損傷[5?6]。因而，適當補充具有清除自由基的外源活性抗氧化物質，能夠有效抵御高強度運動代謝生成氧自由基造成的過氧化損傷，從而保護肝細胞。

黑豆別名烏豆，是黑色種皮的豆科植物。黑豆中的蛋白質具有多種生物學活性，如抗氧化、抗疲勞、延緩衰老等[7]。研究表明蛋白質的生物學活性基于其蛋白質原始序列中肽段的活性，但在蛋白被水解前該活性不顯現[8]。目前生物酶解技術是能夠最大限度保留活性肽營養價值的處理手段，能夠釋放或定向改造食物中的活性肽[9]，將其添加到功能性食品的配方中能夠有效防止與人體氧化應激相關的損傷與疾病[7]。目前，國內外對于食源性活性肽類產品的研究多集中于體外抗氧化的評估，少部分關于體內抗氧化、抗疲勞方向的研究。研究發現水解后的蛋白肽抗氧化活性提高，分子量越小抗氧化活性越強、更易被人體所吸收[10]，并能夠通過抑制肌肉和肝臟內由脂質過氧化產物蓄積而引起的細胞損傷[11?12]。戚穎欣等[13]研究發現，大豆多肽能夠通過降低機體氧化應激水平對急性肝損傷產生保護作用。樊迎等[14]等研究發現，水解小黑豆乳清蛋白能夠使急性肝損傷模型小鼠血清中ALT、AST活性降低，達到保護肝細胞的作用；目前對于黑豆多肽的體內抗氧化活性已有一些相關研究，但對于不同分子量區間黑豆多肽對運動性肝細胞損傷保護的研究較為稀缺。

本實驗擬采用黑豆為原料制備不同分子量區間的黑豆多肽，在此基礎上采用力竭游泳建立超負荷訓練疲勞小鼠模型并飼喂黑豆多肽，以肝臟系數、血清中丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶評判所制黑豆多肽對肝臟保護作用的影響，并測定肝臟抗氧化物酶活性評價機體氧化應激水平，最終通過血清TNF-α含量與NF-κB的相對表達量，對黑豆多肽的抗運動性肝損傷進行綜合評估，為開發具有抗運動性肝損傷類保健品的研制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取個體質量約（20±2.0） g的SPF級昆明種雄性健康小鼠 50只，購自黑龍江中醫藥大學SYXK（黑）2016-004，飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及自由飲水，飼養環境恒定濕度55%，室溫（25±1） ℃，自由進食一周后應用于實驗研究；東北黑豆 市購；PLBC07610millipore超濾膜-3 kDa/5 kDa/10 kDa、8050型超濾杯 默克密理博公司；生化指標檢測試劑盒、ELISA酶聯免疫試劑盒、NF-κB p65羊抗兔單抗、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 碧云天生物技術公司；Lowry蛋白質試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、彩虹180廣譜蛋白Marker 索萊寶科技有限公司；其他所用試劑 為分析純。

BHS-2型恒溫水浴鍋 寧波市鄞州群安實驗儀器有限公司；FC酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；磁力攪拌器 德國IKA公司；UV-2600型紫外可見分光光度計 日本島津公司；垂直電泳轉印系統、GelDoc EZ凝膠成像儀 伯樂生命醫學產品有限公司；恒溫游泳箱 北京智鼠多寶生物科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑豆多肽的制備 黑豆分離蛋白參考高巖松[15]的方法稍加修改，將黑豆研磨后過60目篩網得到黑豆粉，用1:10（M:V）正己烷脫脂三次后與蒸餾水以1:20（M:V）的比例混合，用2 mol/L的NaOH將溶液pH值調至9.0，在4 ℃條件下8000 r/min離心20 min去除不溶雜質。將溶液用2 mol/L的HCl將溶液pH調至4.5將蛋白質沉淀，反復離心水洗蛋白后，將溶液pH調至7.0，于?20 ℃預凍12 h后冷凍干燥處理后得到黑豆分離蛋白。配制黑豆分離蛋白質量濃度約5%的溶液并加入0.2%的Alcalase堿性蛋白酶（24000 U/g），在55 ℃下酶解3 h，滅酶后在4 ℃條件下8000 r/min離心20 min取上清液，經超濾后分別將<3 kDa（F1組），3～5 kDa（F2組），5～10 kDa（F3組）的黑豆多肽冷凍干燥后于密封袋中?20 ℃保存。

1.2.2 動物建模、分組及給藥 動物模型的建立參考文獻[16]，將50只健康雄性小鼠隨機分為5組，設立對照組、模型組、F1組（<3 kDa）、F2組（3～5 kDa）、F3組（5～10 kDa）。采用灌胃法給予樣品容量均0.2 mL/d，設置劑量組100 mg/kg·bw·d（高劑量），模型組、對照組給予等量生理鹽水。對模型組、F1組、F2組、F3組采用力竭游泳訓練建立超負荷訓練模型，游泳箱溫度設置為（25±1） ℃，實驗開始前適應性游泳訓練3 d，隨后每隔一天進行一次力竭訓練游泳，總實驗周期為21 d。當小鼠完全下沉至水面下超過10 s且撈出后無法完成翻正反射，即為力竭。末次力竭運動實驗后，小鼠斷頸處死后摘取眼球取血。

1.2.3 體質量和肝臟指數的測定 小鼠體質量稱重實施于第一次力竭訓練進以及末次訓練進食前，肝臟指數計算按如下公式：

1.2.4 血清TNF-α、ALT、AST的測定 將采集到的新鮮血液于4 ℃靜置1 h后，在3000 r/min條件下分離15 min制取血清。嚴格遵照試劑盒使用說明測定血清中的腫瘤壞死因子（TNF-α）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）。

1.2.5 肝臟T-SOD、GSH-Px、MDA的測定 將采血后的小鼠解剖摘取肝臟并稱重，用生理鹽水處理后搗碎處理成10%組織勻漿，用以測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）含量，剩余樣本保存于?70 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.6 肝臟NF-κB的測定

1.2.6.1 肝臟蛋白的提取 將肝臟組織攪碎后用并PBS緩沖液清洗，在500 r/min條件下分離3 min棄上清液，向各組樣品中加入200 μL的1% PMSF、RIPA，400 W超聲裂解10 s，約3～4次后在14000 r/min條件下分離10 min保留上清液。蛋白質濃度的測定采用索萊寶Lowry試劑盒。

1.2.6.2 Western Blot法 膠片的制備參考試劑盒說明，上樣體積5 μL，分離電壓恒定70 V。轉膜前將膠片置入甲醇中活化5 min后放入上樣緩沖液中平衡10 min，轉膜電壓100 V，時間約2 h。轉膜后將聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride, PVDF）膠片放入TBST中搖洗10 min，隨后置入封閉液中搖床孵育2 h。一抗采用1:1000兔抗鼠單抗于搖床孵育12 h以上，二抗采用1:500羊抗兔二抗搖床孵育2 h。最后將PVDF進行ECL發光，根據曝光效果選取最佳圖片。以兔抗鼠β-actin抗體為內參，通過Image J圖像分析軟件通過灰度計算NF-κB的相對表達量[11]。

1.3 數據處理

應用SPSS 19.0軟件對數據進行。實驗數據以均值±標準偏差（Mean±SD）表示，樣本間比較采用TTest，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用Origin 2017軟件進行圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 體質量與肝臟指數

由表1可知小鼠體質量在造模前后組間均無顯著差異，這是由于小鼠體質量主要隨著喂養時間的增加而逐漸提升，因而在相同環境與飼喂條件下并無差異。

表1 小鼠的體質量變化及肝指數Table 1 Effect on body mass and liver index in mice

肝指數實驗結果顯示，模型組小鼠的肝指數極顯著高于對照組（P<0.01），F3組未能改善力竭超負荷訓練小鼠的肝指數（P>0.05），而F1組與F2組均能夠使小鼠的肝指數極顯著降低（P<0.01）。肝指數是較直觀衡量肝功能的評測指標，當肝臟出現損傷時會出現肥大、水腫、充血等異常現象，導致肝指數水平上升[17?18]。

2.2 血清ALT與AST活性

ALT與AST實驗結果見表2，在本實驗中模型組與對照組相比血清ALT和AST水平極顯著增加（P<0.01），表明該力竭訓練模型下可致使小鼠肝功能受損。ALT分析：F3組未能使ALT含量與模型組出現差異，而F2與F1組均能使ALT活性極顯著降低（P<0.01），且F1能夠使ALT水平恢復到對照組水平。AST分析：與模型組相比，F3組未能使AST活性得到改善，F1組能夠使AST活性極顯著降低（P<0.01），F2顯著降低（P<0.05）。血清ALT和AST水平常被用于評判肝功能是否發生異常，ALT和AST在血清中含量極低，而當肝臟受到刺激導致功能異常時，便會向血液中釋放ALT和AST[19]。吳嚴冰[20]在小鼠力竭游泳實驗以及李志強[21]等在小鼠急性肝損傷實驗中均發現，當小鼠肝臟受損時血清ALT和AST在力竭游泳后升高，對急性肝損傷小鼠實驗中飼喂小黑豆乳清蛋白后血清ALT、AST活力下降與本文結果一致[14]。

表2 小鼠血清生化指標Table 2 Serum biochemical indexes of mice

2.3 小鼠肝臟生化指標

肝臟是機體重要的代謝器官，能夠將各種內、外源性非營養物質轉化，但極易受到生物毒素如活性氧自由基的損傷，活性氧自由基會誘使生物膜發生脂質過氧化反應，導致細胞膜上磷脂降解，破壞細胞膜結構、增大細胞膜通透性，致使肝細胞壞死[22?23]。實驗中，小鼠在進行超負荷運動后能耗需求增加，氧化代謝速度加快使體內蓄積大量活性氧自由基，由于器官、組織中的活性氧自由基的直接測定比較困難，通過測定相應抗氧化物酶活性能夠間接反應機體的氧化應激水平。黑豆多肽對小鼠肝臟生化指標實驗結果見表3。

表3 小鼠肝臟生化指標Table 3 Biochemical indexes of mouse liver

在本實驗中，超負荷訓練使四組小鼠T-SOD、GSH-Px、MDA含量均與對照組差異極顯著（P<0.01）。T-SOD分析：F3組未能使T-SOD活性與模型組出現統計學差異（P>0.05），而F1和F2組與模型組相比均能極顯著提高T-SOD活性（P<0.01），分別提高了33.85%、18.73%。GSH-Px分析：F1、F2、F3三組黑豆多肽均能夠使小鼠肝臟GSH-Px活性極顯著提高（P<0.01），其中F1效果最佳，提升了55.17%，但仍與對照組活性有極顯著差異（P<0.01）。MDA分析：F1、F2、F3三劑量組小鼠肝臟中MDA的含量極顯著低于模型組（P<0.01），其中F1組脂質抗過氧化能力最強，MDA含量最低約降低了14.29%。

SOD與GSH-Px都是參與機體抗氧化反應的關鍵酶。SOD酶是活性氧自由基的唯一底酶，能夠通過歧化反應將超氧陰離子自由基轉化為H2O2和O2，降低自由基在機體內的累積，從而保護機體免受活性氧自由基的攻擊[24]。GSH-Px主要通過分解體內的H2O2和其他氫過氧化物，從而防止組織和細胞免受氧化應激的影響[25]。MDA是細胞膜中不飽和脂肪酸受到過剩氧自由基攻擊，從而發生脂質過氧化損傷的的終產物，它是評價機體氧化應激水平的重要標志物[26]。在該運動性肝損傷模型下，抗氧化物酶活性降低，這可能是由于有氧運動過程中隨著自由基的不斷生成抗氧化物酶如SOD、GSH-Px等逐漸被消耗，進而使自由基生成速率大于清除速率，表現為脂質過氧化終產物MDA的大量蓄積，進而演變為自由基導致的肝臟細胞凋亡[27]。在喂飼不同分子量區間的黑豆多肽后，不同程度上提高了抗氧化物酶的活性，相應降低了肝臟的氧化應激水平從而保護了肝臟細胞，相應反饋為MDA產量降低，其中F1組效果最佳。李明亮等[28]等在小鼠的抗疲勞實驗中發現，喂飼大豆肽和小麥肽能夠提高T-SOD、GSH-Px的酶活性，降低MDA的蓄積從而提高機體抗氧化能力，與本文實驗結果相佐。

2.4 肝組織TNF-α含量與NF-κB的相對表達量

血清TNF-α含量與NF-κB的相對表達量見表4和圖1，結果顯示模型組TNF-α水平極顯著高于對照組（P<0.01），F2、F3組未能顯著降低血清TNFα水平（P>0.05），而F1組能夠使TNF-α水平顯著降低（P<0.01）。NF-κB表達水平經圖像分析處理結果表明，模型組NF-κB相對表達水平極顯著高于對照組（P<0.01），F3組可以顯著降低NF-κB相對表達水平（P<0.05），F2、F1組均能極顯著降低NF-κB相對表達水平（P<0.01）。

表4 TNF-α含量與NF-κB的相對表達量Table 4 TNF-α content and relative expression of NF-κB

TNF-α是一種關鍵細胞因子能夠加速炎癥反應并參與機體的免疫調節[29]，它由巨噬細胞產生，在低濃度時對細胞具有保護作用，但濃度過量會誘使機體出現炎癥反應綜合征，肝臟是其重要的靶器官。NFκB是TNF-α炎癥級聯反應中的重要細胞因子，它不需要新蛋白質合成就能被激活的初級轉錄因子，被認為是有害細胞刺激的第一反應者，其二者含量在運動性肝損傷模型中具有重要意義[30?31]。從飼喂黑豆多肽的結果分析，黑豆多肽能夠有效控制作為炎癥反應啟動因子TNF-α在血清中的分泌，并能夠在肝臟中抑制NF-κB通路的表達控制肝細胞的炎癥反應，達到保護肝臟細胞的目的，與羅安玲[32]在酒精肝損傷小鼠模型中實驗結果一致。

圖1 NF-κB與β-actin的表達Fig.1 Expression of NF-κB and β-actin

3 討論與結論

采用了生物酶解聯合超濾法制備了分子量區間為<3、3～5、5～10 kDa的黑豆多肽，通過力竭游泳超負荷訓練小鼠模型可以發現，黑豆多肽對小鼠肝細胞能夠起到一定保護作用，其中分子量<3 kDa的黑豆多肽對超負荷訓練肝損傷小鼠的肝細胞保護作用最佳，在該劑量組下，小鼠的肝指數、血清ALT、AST水平以及肝臟組織中MDA含量顯著降低，肝組織中T-SOD、GSH-Px活性顯著提升，通過TNF-α水平以及NF-κB相對表達水平的降低，進一步驗證黑豆多肽能通過抑制炎癥通路的表達保護肝臟細胞。綜上可以得出以下結論，黑豆多肽對肝細胞的保護作用強度與分子量大小負相關，分子量較低（<3 kDa）的黑豆多肽具有更強的體內抗氧化活性、更強的自由基清除能力，從而能夠更有效抑制脂質過氧化產物在機體內的蓄積，一定程度上防止或緩解脂質過氧化損傷，并且能夠一定程度上抑制炎癥反應的通路起到防止細胞損傷的作用。

目前我國對于肽類產品的應用已有較完善的國家標準（GB24154-2015），本實驗所制備黑豆蛋白肽不但適用于中、高強度運動后恢復類蛋白肽類產品的研發，也可以用作復合抗氧化產品的壁材、輔料，并能夠為黑豆蛋白肽與其他具有抗氧化、抗肝細胞損傷的生物活性物質間的協同作用的研究提供參考。