甲魚肽對果蠅壽命及其抗氧化活性的影響

史晉源，鐘 浩，王倩倩，駱賢亮，王 晶，余 鵬，馮鳳琴,

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州 310058；2.農業部農產品采后處理重點實驗室，浙江杭州 310058；3.浙江大學寧波研究院，浙江寧波 315100；4.余姚市冷江鱉業有限公司，浙江寧波 315400）

衰老，通常是指隨年齡的增長生物發育達到成熟期后，器官和組織逐步發生退行性變化，出現不可逆的生理衰退的現象。衰老會誘導一些常見的疾病如癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經退行性疾病的發生[1]。由于衰老涉及到多種分子機制，因此衰老的原因尚沒有明確定論，目前較為有代表性的衰老學說是Harman等[2]提出的自由基損傷學說。正常情況下，機體內存在一套完整的抗氧化機制，可以清除多余的自由基[3]，包括一些酶類自由基清除劑，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等。隨著機體衰老的發生和持續，這種氧化-還原平衡機制被打破，造成體內自由基過剩進一步引發脂質的過氧化，產生代謝產物丙二醛（malondialdehyde，MDA），從而造成細胞代謝及功能障礙，加速機體的衰退老化。當今社會人口老齡化加劇，延緩衰老，延長人口壽命具有重要的現實意義。以往研究表明生物活性肽有較好的抗氧化活性[4]，具有潛在的延緩機體衰老的作用。紅唇魚膠原蛋白肽可以通過降低活性氧（ROS）和MDA的水平以及激活細胞內SOD、CAT和GSH-Px來保護HepG2細胞免受H2O2誘導的氧化損傷[5]；貽貝肽可以降低小鼠腦組織中乳酸水平，抑制iNOS（induced nitric oxide synthase）活性，維持NO（nitric oxide）平衡，促進神經細胞存活，延緩D-半乳糖致衰老小鼠的腦退行性變化[6]；葉瓜參酶解物具有較強的抗氧化活性，可以顯著延長果蠅的壽命并改善D-半乳糖致衰小鼠的學習和記憶損傷[7]。由此可見，生物活性肽在抗衰老方面潛力巨大，開發新型抗衰老活性肽具有重要的科學意義。

甲魚又稱鱉、腳魚，是一種水生經濟動物，在我國一直被視為營養美容食品，素有強身健體、延年益壽之功效[8]。甲魚富含蛋白質、礦物質元素和不飽和脂肪酸，具有較高的保健作用和經濟價值[9]。甲魚蛋白經過酶解后可得到甲魚肽（soft-shelled turtle peptide, STP），研究表明甲魚肽具有多種生理功能，屈思雨等[9]發現甲魚肉蛋白酶解物表現出較好的ABTS和氧自由基清除能力；Wang等[10]從中華鱉蛋白水解物中分離出三種新型抗增殖肽，對人肺癌細胞A549具有抗增殖活性；還有研究通過酶解鱉甲制備出兩種活性肽，可以非競爭性抑制血管緊張素I轉化酶[11]。目前對甲魚肽的研究主要集中體外抗氧化、抗腫瘤、調節免疫、降血壓等功能，但在壽命及體內抗氧化活性層面的研究還較少。因此，研究甲魚肽對壽命及體內抗氧化活性的影響可以為探究其潛在的抗衰老功能提供一定的理論基礎。在抗衰老研究中，果蠅常作為衰老試驗的動物模型，其優點在于生命周期短、繁殖力強、遺傳背景清晰、成本低[12]。因此本實驗選取果蠅為動物模型，以添加不同劑量的甲魚肽的培養基飼喂果蠅，通過果蠅的生存試驗及測定果蠅體內SOD、CAT活力和MDA含量，來評價甲魚肽對果蠅壽命及其體內抗氧效果，以期為甲魚肽的抗衰老相關產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲魚 冷江鱉業有限公司；動物蛋白酶A1 南寧龐博生物工程有限公司；黑腹果蠅野生型Canton-S

浙江大學食品生物科學技術研究所饋贈；酵母粉、玉米粉、白砂糖 市場購買；SOD、MDA、CAT、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒 南京建成生物有限公司；氯化鈉、丙酸、瓊脂 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑 分析純，上海國藥集團。

DKS-24電熱恒溫水浴鍋 嘉興市中新醫療儀器有限公司；R-1005長城旋轉蒸發儀 鄭州長城儀器有限公司；冷凍干燥機 北京博醫康試驗儀器有限公司；通風柜 浙江三和科教儀器有限公司；智能人工氣候箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；-80 ℃ZKU-LZ型超低溫冰箱 中科生命科技股份有限公司；BS124型分析電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；Infinite M2000酶標儀瑞士Tecan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲魚肽的制備 方法參考李琳等[13]的制備方法，將購于冷江鱉業有限公司的甲魚，清洗干凈, 切塊后包裝于雙層聚乙烯袋中, 置于?20 ℃冷凍備用。甲魚肽的制備流程如下：甲魚→蒸煮3 h→去脂→勻漿→加入蛋白酶0.4%→50 ℃酶解6 h→沸水浴中滅酶20 min→過濾→10000 r/min 離心15 min→取上清液→冷凍干燥→甲魚肽粉。

1.2.2 甲魚肽的分子質量及分布 采用凝膠過濾色譜法分析甲魚肽分子質量分布[14]。樣品處理方法：稱取0.02 g樣品，用流動相定容至10 mL，混勻過0.22 μm的微孔濾膜后進樣。

色譜條件：TSKgel 2000 SWXL分析柱（300 nm×7.8 mm）；流動相體積比為乙腈:水:三氟乙酸=450:550:1（v/v/v）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；運行時間40 min；選用細胞色c（分子質量12400 Da）、抑肽酶（分子質量6512 Da）、桿菌肽（分子質量1450 Da）、甘氨-甘氨-色氨-精氨酸（分子質量451 Da）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（分子質量189 Da）為標準品。以保留時間對標準品的相對分子質量對數作標準曲線，得到y=?0.2187x+6.7329（R2=0.9901），其中，y為標準肽樣品分子質量的對數，x為保留時間，min，從而得到甲魚肽的相對分子質量。

1.2.3 氨基酸組成的測定

1.2.3.1 樣品前處理 參考呂艷[15]的方法，精確稱取20 mg樣品于消解瓶中，加入1 mL 6 mol/L HCl后立即充入氮氣并封口，移入150 ℃恒溫箱中加熱1.5 h，取出冷卻；氨基酸標液：準確稱取氨基酸對照品各10 mg于25 mL容量瓶中，加0.1 mol/L HCl超聲溶解并定容。

1.2.3.2 氨基酸的衍生化反應 流動相A：0.1mol/L乙酸鈉溶液（含3%乙腈和0.1%三乙胺），用乙酸調節pH至6.5；流動相B：80%乙腈，使用前超聲脫氣處理；再干燥液為乙醇:水:三乙胺=2:2:1；衍生溶液為異硫氰酸苯酯:乙醇:三乙胺:水=1:7:1:1；樣品稀釋液為流動相A:流動相B=9:1；衍生條件：取1、5、10、15、20 μL氨基酸標準液和6 μL水解液分別置于1.5 mL離心管，氮氣吹干后加入10 μL再干燥液，氮氣吹干后加入20 μL衍生溶液并渦旋混勻，室溫靜置20 min后再次氮氣吹干，加入50 μLB相，渦旋混勻后再加入450 μLA相，再次渦旋混勻后過膜、上機。

1.2.3.3 高效液相色譜的測定條件 色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；柱溫38 ℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm；流速1.0 mL/min；流動相A為0.1 mol/L乙酸鈉溶液（含3%乙腈和0.1%三乙胺），用乙酸調pH至6.5；流動相B：80%乙腈（表1）。

1.2.4 果蠅培養基的制備基 礎培養基配方為純水1000 mL、玉米粉105 g、瓊脂7.5 g、蔗糖75 g、酵母粉40 g和丙酸5 mL。參考肖發[16]的方法，將蔗糖和瓊脂一同放入鍋中，不斷攪拌直至瓊脂條融化，加入酵母粉后繼續攪拌，最后加入沖調好的玉米糊，不斷攪拌直至飼料粘稠，停止加熱，置于高壓滅菌鍋滅菌。冷卻至80 ℃后加入5 mL丙酸，充分攪拌后置于60 ℃水浴保溫。樣品培養基配制方法：在基礎培養基中添加甲魚肽，分別配制質量濃度為0.2%、0.4%、0.8%的低、中、高劑量的培養基，攪拌均勻后分裝于瓶（40 g/瓶）和試管（5 g/管）中，室溫放置凝固后再轉移到培養箱中備用。

表1 梯度洗脫時間Table 1 Gradient elution time

1.2.5 果蠅生存實驗 在基礎培養基中按照0.2%、0.4%和0.8%的比例添加甲魚肽飼喂果蠅，以基礎飼料飼喂的果蠅為對照組。選取24 h內羽化的果蠅，二氧化碳麻醉后鑒定性別，然后將果蠅置于各實驗組的試管中進行飼喂，每支試管飼喂10只果蠅，每個試驗組雌雄果蠅各設置10個重復。將各組果蠅置于25 ℃恒溫培養箱中培養，每3 d更換新的培養基，同時記錄果蠅死亡數量，直至果蠅全部死亡。參考王耀輝等[17]的方法，統計果蠅的半數死亡時間、最高壽命和平均壽命，并以果蠅的存活率為縱坐標，培養天數為橫坐標分別繪制雌雄果蠅的生存曲線。平均壽命、最高壽命、半數死亡時間和存活率的計算公式如下：

1.2.6 果蠅抗氧化活性實驗 參考張明等[18]的實驗方法并稍作調整。于20、40 d時，將各組果蠅麻醉后加入冰冷的生理鹽水制備10%組織勻漿。于4 ℃，8000 r/min離心20 min，取上清液測定相關抗氧化指標。參照試劑盒說明書，測定每組雌雄果蠅上清液中總SOD活性、MDA含量及CAT活力。

1.3 數據處理

數據以Mean±SD表示，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），和對照組相比，*，差異顯著（P<0.05），**，差異極顯著（P<0.01）。使用Graphpad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 甲魚肽分子質量分布

近幾年研究發現，小分子量的肽段具有較高的抗氧化活性，申彩紅[19]發現分子量在130～2000 Da的海參寡肽的抗氧化性優于2000～5000 Da的海參多肽。趙翊君[20]發現鱸魚魚肉酶解產物中最小的肽段表現出最強的抗氧化能力。由圖1和表2可知，甲魚肽的分子質量主要集中在1000 Da以下，相對含量為93.23%。按照氨基酸殘基評價分子量110 Da估算[21]，甲魚肽中二肽和三肽（180～500 Da）的組分含量較多，相對含量約為56.05%。說明甲魚肽主要以小分子肽段為主，具有潛在的抗氧化活性。

圖1 甲魚肽的分子質量分布Fig.1 The molecular weight profile of STP

表2 甲魚肽分子質量分布Table 2 Molecular mass distribution of STP

2.2 甲魚肽氨基酸組成

脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸被普遍認為具有抗氧化活性[6,14]，其中亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸這類支鏈氨基酸可以延長酵母、小鼠的平均壽命，具有延緩衰老的潛能[22?23]，精氨酸也與延緩衰老及衰老相關疾病密切相關[24]。如表3所示，甲魚肽中具有抗氧化活性的7種氨基酸含量為43.51%。同時，甲魚肽中亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸這三種支鏈氨基酸含量較高，約為17.70%，精氨酸的含量為4.11%。因此，甲魚肽富含抗氧化和抗衰老活性的氨基酸，推測其可能具有延緩衰老的作用。

表3 甲魚肽氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of the STP

2.3 甲魚肽對果蠅壽命的影響

壽命是評價抗衰老藥物效果的重要指標，壽命試驗又稱為生存試驗，可以通過統計果蠅的平均壽命、半數死亡時間和最高壽命來研究衰老規律和抗衰老效應[6]。由表4可知，甲魚肽高劑量組的雌果蠅和雄果蠅半數死亡時間均顯著高于對照組（P<0.05），高劑量組的雌雄果蠅相比對照組分別延長了6 d和9 d，中劑量組雖然也延長了雌雄果蠅的半數死亡時間，但無顯著性差異（P>0.05）。所有實驗組均表現出延長雌、雄果蠅的平均壽命的效果。低、中、高劑量組的雌性果蠅的平均壽命分別延長了1.51%、3.87%、10.80%，其中高劑量組與對照組相比有顯著性差異（P<0.05），低、中、高劑量組雄性果蠅的平均壽命分別延長了2.29%、6.01%、14.01%，其中高劑量組與對照組相比有極顯著性差異（P<0.01）。不同劑量的甲魚肽均表現出延長雌雄果蠅的平均最高壽命的效果，相比對照組，高劑量組雌性果蠅的平均最高壽命極顯著延長了6.35%（P<0.01），中劑量組、高劑量組雄性果蠅的平均最高壽命分別顯著延長了5.71%、13.22%（P<0.01）。雄果蠅的半數死亡時間、平均壽命、平均最高壽命均比雌果蠅增加幅度大，說明甲魚肽對雄果蠅壽命影響略高于雌果蠅，這可能是雌性果蠅與雄性果蠅對受試藥物的敏感性不同造成的[25]。

圖2是雌雄果蠅的生存曲線，由圖2可知，在0～20 d，對照組和各劑量組存活率差異不顯著（P>0.05），之后實驗組的曲線逐漸高于對照組，各劑量組的存活率均高于對照組，且高劑量組的延壽效果最好。綜合表4和圖2的結果，分析果蠅半數死亡時間、平均壽命、平均最高壽命及果蠅不同時期的存活率，發現高劑量組延長雌雄果蠅壽命的效果最好。

表4 甲魚肽對果蠅壽命的影響Table 4 Effects of STP on life span in D. melanogaster

圖2 甲魚肽喂養雌性果蠅（A）與雄性果蠅（B）的生存曲線Fig.2 The survival curves of female(A) and male(B) D.melanogaster which treating with STP

2.4 甲魚肽對果蠅體內抗氧化活性的影響

自由基學說是目前較有說服力的衰老理論之一，它認為隨著衰老的發生，機體抗氧化酶活力降低，因此機體清除自由基能力降低，代謝累積形成的自由基會對機體造成氧化損傷[26]。SOD可以使轉化為H2O2，而H2O2可以被CAT轉化為 H2O[27]。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的終產物, 具有細胞毒性，可間接反映機體的脂質過氧化程度[28]。

2.4.1 甲魚肽對SOD活力的影響 SOD作為體內抗氧化酶之一，可以清除自由基，使轉化為 H2O2，保護機體組織[29]。不同劑量甲魚肽對雌性和雄性果蠅體內 SOD活力的影響見表5，將飼喂基礎飼料的果蠅作對照，考察了果蠅在20和40 d時體內SOD的活力。20 d時，相比對照組，高劑量組的雌果蠅體內的SOD活力提高了26.22%（P<0.01）。40 d時，相比對照組，中、高劑量組的雌果蠅的SOD活力分別提高了8.08%（P<0.05）和28.40%（P<0.01）。20 d時，中、高劑量組雄果蠅的SOD活力相比對照組分別提高了5.32%（P<0.05）和7.07%（P<0.01）。40 d時，相比對照組，中、高劑量組雄果蠅的SOD活力比對照組分別提高了9.84%（P<0.05）和15.08%（P<0.01）。結果表明，飼喂甲魚肽能夠提高果蠅體內SOD活力，且有劑量依賴性。

表5 甲魚肽對果蠅SOD活力的影響Table 5 Effects of STP on SOD activity in D. melanogaster

2.4.2 甲魚肽對MDA含量的影響 隨著年齡的增長，機體清除自由基能力下降，自由基的堆積使脂質發生過氧化反應生成代謝產物MDA[30]。MDA的含量間接反映了衰老果蠅中細胞的損傷嚴重程度，是研究衰老的重要指標。不同劑量甲魚肽對雌性和雄性果蠅體內MDA活力的影響見表6。由表6可知，MDA含量隨著果蠅生長時間的延長而呈現升高的趨勢，這是因為隨著果蠅的衰老，清除體內自由基的能力降低，體內脂質過氧化物增多[31?32]。雄果蠅體內MDA含量低于雌果蠅，這可能是由于雄蠅體內的脂質含量少，過氧化脂質程度較低，這與張碧瑩等[33?34]研究結果一致。

20 d時，相比對照組，高劑量組的雌果蠅體內MDA含量下降了27.27%（P<0.05），其他劑量組MDA含量也有所降低，但無顯著性差異（P>0.05）；40 d時，相比同時間的對照組，中、高劑量組的雌果蠅體內MDA含量分別下降了19.44%（P<0.05）和33.33%（P<0.01）。第20 d時，相比對照組，中、高劑量組的雄果蠅體內MDA含量下降了24.00%（P<0.05）和36%（P<0.01）；40 d時，相比同時間的對照組，中、高劑量組的雄果蠅體內MDA含量分別下降了23.07%（P<0.05）和34.62%（P<0.01）。綜上所述，MDA含量會隨著年齡增長而增加，不同質量濃度的甲魚肽能夠降低果蠅體內MDA含量，且有劑量依賴性。

表6 甲魚肽對果蠅MDA含量的影響Table 6 Effects of STP on MDA content in D. melanogaster

2.4.3 甲魚肽對CAT活力的影響 過氧化氫酶也是機體抗氧化酶體系的重要一員，可以通過清除機體產生的 H2O2，降低組織中過氧化物的產生來延緩衰老[34]。不同劑量甲魚肽對雌性和雄性果蠅體內CAT活力的影響見表7。由表7可知，20 d時，相比對照組，低、中和高劑量組的雌果蠅體內CAT活力提高了39.73%（P<0.05）、69.16%（P<0.01）和53.67%（P<0.01）。40 d時，相比同時間的對照組，中、高劑量組的雌果蠅體內CAT活力分別提高了37.64%（P<0.05）和33.50%（P<0.05）。對于雄果蠅，20 d時，相比對照組，中、高劑量組的雄果蠅體內CAT活力提高了33.46%（P<0.05）和42.36%（P<0.01）。40 d時，相比同時間的對照組，中、高劑量組的雄果蠅體內CAT活力提高了30.79%（P<0.01）和38.05%（P<0.01）。綜上所述，不同質量濃度的甲魚肽能夠提高果蠅體內CAT活力。

表7 甲魚肽對果蠅CAT活力的影響Table 7 Effects of STP on CAT activity in D. melanogaster

3 結論

甲魚肽以相對分子質量介于180～500 Da的肽段為主，且含有較為豐富的具有抗氧化活性的氨基酸：如脯氨酸、賴氨酸和亮氨酸等。不同劑量的甲魚肽均能延長雌雄果蠅的壽命，提高其體內抗氧化指標，并且在相同劑量下，甲魚肽對雄果蠅延長壽命及提高體內抗氧化活性的效果優于雌果蠅。綜上所述，本研究推測甲魚肽具有潛在的抗衰老功效，為甲魚肽在醫藥、保健品領域中的應用提供了一定的參考。但由于衰老機制較為復雜，后續可在大鼠和細胞的水平上進一步開展抗衰老功能的研究，為甲魚肽抗衰老的作用提供更多的依據。