癸源煎配方顆粒對卵巢儲備功能下降模型小鼠的改善作用及機制研究

王月嬌 孫兆貴 徐蓮薇 郁琳 張瑜 劉小菲 李盛楠 叢超 趙莉

中圖分類號 R271.9;R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）09-1051-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.05

摘 要 目的：研究癸源煎配方顆粒（GDFG）對卵巢儲備功能下降（DOR）模型小鼠的改善作用及機制。方法：將動情周期正常的42只雌性ICR小鼠隨機分為對照組、模型組、戊酸雌二醇組（陽性對照，0.15 mg/kg）和GDFG低、中、高劑量組（0.75、1.49、2.98? ? ? ?g/kg），每組7只。除對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射順鉑（3 mg/kg）復制DOR模型。造模成功后，給藥組小鼠灌胃相應藥物，模型組和對照組小鼠灌胃生理鹽水，每天1次，連續4周。末次給藥后，采用酶聯免疫吸附試驗測定小鼠血清中抗米勒管激素（AMH）和促卵泡生成素（FSH）水平;采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察小鼠卵巢組織病理學形態;采用免疫組化法觀察小鼠卵巢組織中AMHR受體Ⅱ（AMHRⅡ）、Smad4蛋白的分布情況;采用Western blot法檢測小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的表達水平。結果：與對照組比較，模型組小鼠血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），血清中FSH水平顯著升高（P<0.01）;卵泡組織中可見卵泡皺縮、卵泡核丟失、卵巢間質纖維化、黃體疏松; AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡膜上和卵巢間質中。與模型組比較，GDFG各劑量組小鼠血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），血清中FSH水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;卵巢組織中可見各級卵泡、卵泡形態改善，未見明顯核丟失和卵丘形成;AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核（GDFG高劑量組除外）及卵巢顆粒細胞膜上（GDFG中劑量組以分布在竇卵泡為主），成熟卵泡核周圍或黃體中有少許分布。結論：GDFG可改善DOR模型小鼠的卵巢功能，其機制可能與升高血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平，改善AMHRⅡ、Smad4蛋白在卵巢顆粒細胞膜和卵泡核內的分布以及降低血清中FSH水平有關。

關鍵詞 卵巢儲備功能下降;癸源煎配方顆粒;抗米勒管激素;促卵泡生成素;抗米勒管激素Ⅱ受體;Smad4;小鼠

Study on Improvement Effects and Its Mechanism of Guiyuan Decoction Formula Granules on Model Mice with Decreased Ovarian Reserve

WANG Yuejiao1，2，SUN Zhaogui3，XU Lianwei2，YU Lin3，ZHANG Yu3，LIU Xiaofei1，LI Shengnan2，CONG Chao1，ZHAO Li1（1. Dept. of Gynaecology， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM， Shanghai 200032， China; 2. Longhua Clinical Medical College， Shanghai University of TCM， Shanghai 200032， China; 3.Shanghai Institute of Planned Parenthood Research， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects and its mechanism of Guiyuan decoction formula granules （GDFG） on model mice with decreased ovarian reserve （DOR）. METHODS： Totally 42 female ICR mice whith with normal estrous cycle were randomly divided into control group， model group， estradiol valerate group （positive control， 0.15 mg/kg） and GDFG low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.75， 1.49， 2.98 g/kg）， with 7 mice in each group. Except for control group， other groups were given cisplatin （3 mg/kg） intraperitoneally to establish DOR model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically; model group and control group were given normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. After last administration， ELISA assay was used to measure the serum levels of anti-Müllerian hormone （AMH） and follicle-stimulating hormone （FSH） in mice. Histopathological morphology of ovarian was observed by HE staining. Protein distribution of AMH receptor Ⅱ（AMHRⅡ） and Smad4 in ovarian tissue were observed by immunohistochemistry. Protein expression of AMHRⅡ and Smad4 were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with control group， the serum level of AMH， the expression of AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian tissue in model group were significantly decreased （P<0.01）， while the FSH level in serum was significantly increased （P<0.01）; follicles were crumpled and lost nucleus， ovarian interstitial were fibrosis， luteum were loose; AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian tissue were mainly distributed in the follicle membrane and ovarian interstitial. Compared with model group， the serum level of AMH， the expression of AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian tissue was increased significantly in GDFG groups （P<0.01）， while the serum level of FSH was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; in ovarian tissue， follicles at all levels could be found and follicle morphology was improved， and no obvious nuclear loss and cumulus formation were found; AMHRⅡ and Smad4 protein were mainly distributed in the follicular nucleus （except for GDFG high-dose group） and the granular cell membrane （mainly distributed in the sinus follicles of GDFG medium-dose group）; they were slightly distributed around the mature follicular nucleus or in corpus luteum. CONCLUSIONS： GDFG can improve ovarian function of DOR model mice. The mechanism may be related with promoting serum level of AMH， protein expression of AMHRⅡ and Smad4， improving the distribution of AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian granulosa cell membrane and follicular nucleus， reducing FSH levels.

KEYWORDS? ?Decreased ovarian reserve; Guiyuan decoction formula granules;Anti-Müllerian hormone; Follicle stimulating hormone; Anti-Müllerian hormone receptor; Smad4; Mice

卵巢儲備功能下降（DOR），是指卵巢內卵母細胞的數量減少和（或）質量下降，同時伴有抗米勒管激素（AMH）水平降低、竇卵泡數減少、促卵泡生成素（FSH）水平升高、患者生育能力下降[1]。DOR臨床表現有月經后期（即月經周期延后7天及以上）、經量減少等，其進一步發展可出現月經頻發或月經稀發、閉經，甚至卵巢早衰、生育能力喪失[2]。DOR的病因尚不明確，目前普遍認為其是由多因素所致，如基因損傷、染色體異常、自身免疫損傷、手術損傷、放化療、感染等;另外，環境變化、生活習慣或嗜好不良，亦可促進DOR的發生發展[3-8]。

目前，西醫臨床對DOR并無特效治療方法，一般以調節生活方式、干預心理狀態、激素補充等治療為主[9]。DOR屬于中醫婦科學“月經后期”“月經過少”等疾病范疇，中醫治療多以滋腎填精、調理沖任、濡養胞宮等為主[10-11]。癸源煎處方是由明代醫學大家張介賓的《景岳全書》[12]中“地黃醴”一方加味而成，由熟地黃、枸杞子、肉蓯蓉、仙靈脾、菟絲子、雞血藤、香附等7味藥物組成，現已被上海中醫藥大學附屬龍華醫院院開發成院內制劑“癸源煎配方顆粒”（以下簡寫為“GDFG”）。經本課題組前期臨床研究發現，該配方顆粒對于DOR患者有較好的改善癥狀，可保護患者的卵巢功能[13]。目前，本課題組也正在進行GDFG的多中心、大樣本的臨床隨機雙盲試驗，以期為其上市奠定基礎。

相關研究發現，卵巢顆粒細胞異常增殖或凋亡、卵泡發育不良、優勢卵泡形成減少，可導致DOR[14-15]。其中，卵泡的發育主要經歷募集、選擇、成熟等生物過程，其募集與選擇過程受AMH、FSH調控：AMH一方面可防止2～8 mm的小竇卵泡過度增長，并降低竇卵泡對FSH的敏感性，從而促進優勢卵泡的選擇，進而有效防止卵泡池耗竭、調控卵泡生長[16];另一方面，AMH可與AMH受體Ⅱ（AMHRⅡ）結合，然后經過信號傳導與公共蛋白Smad4相結合，從而進入細胞核內調控卵巢功能相關基因的表達[17]。然而，GDFG是否可通過AMH/Smad信號通路改善DOR的作用機制尚不明確，基于此，本研究采用腹腔注射順鉑以復制DOR模型小鼠，通過不同劑量GDFG干預后，檢測小鼠血清中AMH、FSH的水平，觀察其卵巢組織形態和卵泡發育情況，并檢測其卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的分布和表達水平，以探討GDFG改善卵巢儲備功能的機制，以期為中醫藥防治DOR提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：MK3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Multizoom AZ100型光學生物顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]、GH-200型萬分之一電子天平（日本A&D公司）、Centrifuge5804R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、RM2125RTS型石蠟切片機（瑞士Lecia公司）、TissueRuptor Ⅱ型手持式勻漿器（德國Qiagen公司）、Tanno 5200型化學發光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，批號FA4A8106A，規格10 mg），GDFG（四川新綠色藥業科技發展有限公司），戊酸雌二醇（拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號J20171038，規格1 mg），血清AMH、FSH酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海欲鵬生物科技有限公司，批號分別為LA374189、LF374103），兔源AMHRⅡ單克隆抗體、兔源Smad4單克隆抗體、兔源GAPDH多克隆抗體、ECL化學發光試劑（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為PB1037、PB0446、A00227-1、AR1191），生物素高效標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）多克隆抗體（二抗）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、山羊血清、RIPA裂解液、BSA溶液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為A0279、C0221A、C0265、P0013C、ST025、P0012S、P0202），TBST緩沖液（美國Sigma公司，批號91414-10TAB），生理鹽水（上海百特醫療用品有限公司，批號H19994067）;其余試劑為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級ICR小鼠，雌性，8周齡，體質量為25～30 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養于上海市計劃生育科學研究所清潔級動物實驗中心，環境溫度為24 ℃、濕度為60%、晝夜光照節律為12 h。飼養期間飼料及飲用水充足，動物可自由飲食、進水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

小鼠適應性喂養5 天后，根據文獻[18-19]方法對小鼠進行陰道脫落細胞學檢查，篩選出動情周期正常的小鼠共42只，然后隨機分為對照組、模型組、戊酸雌二醇組（陽性對照，0.15 mg/kg，劑量根據臨床等效劑量換算而得）和GDFG低、中、高劑量組（0.75、1.49、2.98 g/kg，劑量分別為臨床等效劑量的0.5、1、2倍），每組7只。除對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射順鉑（3 mg/kg，以生理鹽水溶解）復制DOR模型。造模期間各組小鼠每天上午9時進行陰道脫落細胞學檢查：當其陰道上皮細胞、角化細胞明顯減少，白細胞明顯增多時，表明造模成功。造模成功后，GDFG各劑量組和戊酸雌二醇組小鼠每日上午9時灌胃相應藥液0.3 mL（臨用時以生理鹽水溶解），對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，連續給藥4周。

2.2 小鼠血清中AMH、FSH水平的檢測

采用ELISA法進行檢測。末次給藥后，各組小鼠通過腹腔注射2%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）麻醉后，于腹主動脈采血。血樣于室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書相關方法操作，采用酶標儀于450 nm波長下測定血清中AMH、FSH的水平。

2.3 小鼠卵巢組織的病理學形態觀察

各組小鼠采血后，處死，取其左側卵巢組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，經70%、80%、90%、95%乙醇和無水乙醇梯度脫水，再以二甲苯透明替換、浸蠟、包埋、切片（厚度約5 μm），平行制備6片。將石蠟切片以二甲苯分次脫蠟，于無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇中逐級浸泡，然后以水沖洗。各小鼠取2片切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色（另外4片后續進行免疫組化實驗），然后于光學顯微鏡下觀察卵巢組織的病理學形態。

2.4 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的分布情況檢測

采用免疫組化法進行檢測。取“2.3”項下各小鼠另外4片切片，經脫蠟并復水后，以PBS沖洗5 min×3次，滴加3%H2O2室溫靜置10 min;以PBS沖洗5 min×3次，置于枸緣酸鈉溶液中煮沸10 min以熱修復抗原;冷卻后以PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊血清進行封閉，室溫靜置20 min;甩去多余液體，滴加AMHRⅡ、Smad4一抗（稀釋度均為1 ∶ 500 ）50 ?L，室溫靜置1 h;以PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000）50 ?L，室溫靜置1 h;以PBS沖洗5 min×3次，經DAB顯色10 min后，以PBS沖洗10 min后脫水封片，并于光學顯微鏡下觀察，拍照。當切片中出現明顯的棕黃色顆粒則為陽性表達，出現不著色或淺色則為陰性表達。

2.5 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.3”項下各組小鼠右側卵巢組織，剪碎，按照每20 mg組織加入200 μL裂解液的比例加入RIPA裂解液，于勻漿機中研磨，直至裂解液中組織塊消失。充分裂解后，以12 000 r/min離心5 min，取上清液，以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳分離，然后轉膜70 min，以5% BSA溶液室溫封閉2 h;以TBST洗膜5 min×3次，加入AMHRⅡ、Smad4、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 500），孵育過夜;以TBST洗膜5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），孵育1 h;以TBST洗膜5 min×3次，經ECL顯色后，置于凝膠成像儀中曝光成像。采用Image J 1.8.0軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以AMHRⅡ、Smad4與內參GAPDH的灰度值的比值表示相應蛋白表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。數據以x±s表示。多組間比較，若數據符合正態分布且方差齊性采用單因素方差分析;若方差不齊，以Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠血清中AMH、FSH水平的測定結果

與對照組比較，模型組小鼠血清中AMH水平顯著降低，FSH水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠血清中AMH水平均顯著升高（P<0.01），FSH水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 小鼠卵巢組織病理學形態觀察結果

對照組小鼠卵巢組織中可見各級卵泡，竇卵泡、排卵前卵泡形態正常，卵泡液充盈，黃體致密，血管規則;與對照組比較，模型組小鼠卵巢組織中可見卵泡皺縮、卵泡核丟失、卵巢間質纖維化、黃體疏松、卵泡液減少，出現閉鎖卵泡;與模型組比較，戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中可見各級卵泡、卵泡形態改善，未見明顯核丟失和卵丘形成，詳見圖1。

3.3 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白的分布情況

對照組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵巢顆粒細胞膜上及卵泡核內，卵泡膜及黃體上亦有分布;模型組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡膜及卵巢間質;戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核（GDFG高劑量組除外）及卵巢顆粒細胞膜上（GDFG中劑量組以分布在竇卵泡為主），成熟卵泡核周圍或黃體中有少許分布，詳見圖2。

3.4 小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平檢測結果

與對照組比較，模型組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，戊酸雌二醇組和GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），詳見圖3、表2。

4 討論

AMH是反映女性卵巢儲備功能、評估女性生殖能力的重要指標：AMH由巢內竇前卵泡和小竇卵泡的卵巢顆粒細胞分泌，通過其自分泌及旁分泌作用，抑制原始卵泡募集、減少竇前卵泡和小竇卵泡對FSH的依賴性生長，促進優勢卵泡選擇，對于卵泡發育成熟有重要的調節作用;AMH分泌減少可導致原始卵泡的募集增加、小竇卵泡對FSH的敏感性增強、卵泡過度生長，加速卵泡儲備池耗竭[16]。AMH主要有AMHRⅠ、AMHRⅡ兩類受體，AMHRⅡ主要分布在卵巢顆粒細胞膜上，可與AMH直接結合，通過骨形態發生蛋白樣激酶磷酸化后與AMHRⅠ形成異聚體復合物，再通過與Smad1/5/8受體蛋白結合并激活公共受體Smad4，從而發揮調控發育的作用[21-22]。但是，當AMHRⅡ蛋白分布于成熟卵泡和間質上時，與AMH結合后，將不能與Smad4結合，從而不發揮調控發育的作用[23-24]。

GDFG是我院婦科用于治療DOR的常用制劑，經臨床研究也發現其可調節患者月經周期、恢復生殖軸、改善卵巢功能，但其作用機制尚不明確[13]。基于此，本研究建立了DOR小鼠模型，以探討GDFG改善DOR的潛在作用機制。

順鉑為鉑類化合物，是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，具有生殖毒性[18-19]，故本研究通過對8周齡ICR小鼠一次性腹腔注射順鉑以復制DOR模型，造模成功后，以臨床常用雌激素戊酸雌二醇為陽性對照，進行干預。結果發現，模型組小鼠血清中AMH水平顯著降低，FSH水平顯著升高;卵巢組織出現閉鎖卵泡，卵泡形態皺縮、核丟失、卵泡液減少，且AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核及卵巢間質，其蛋白表達水平顯著降低。經藥物連續干預4周后發現，GDFG各劑量組小鼠血清中AMH水平均顯著升高，FSH水平均顯著降低;卵巢組織中卵泡形態改善、未見明顯核丟失和卵丘形成，且AMHRⅡ、Smad4蛋白表達水平均顯著升高。GDFG各劑量組小鼠卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4蛋白主要分布在卵泡核（GDFG高劑量組除外）及卵巢顆粒細胞膜上（GDFG中劑量組以分布在竇卵泡為主），成熟卵泡核周圍或黃體中有少許分布。由此說明，GDFG可通過改善AMHRⅡ、Smad4蛋白在卵巢顆粒細胞膜及卵泡核內的分布，減弱AMHRⅡ、Smad4蛋白分布于卵巢間質的傾向，從而促進AMH/Smads信號通路的傳導，進而降低血清中FSH水平。

綜上所述，GDFG可改善DOR模型小鼠的卵巢功能，其機制可能與升高血清中AMH水平和卵巢組織中AMHRⅡ、Smad4表達水平，改善AMHRⅡ、Smad4蛋白在卵巢顆粒細胞膜及卵泡核內的分布，降低血清中FSH水平有關。后續本課題組將研究GDFG干預小鼠卵巢顆粒細胞AMH/Smads 信號通路的具體環節和靶點，以期觀察該制劑對卵巢顆粒細胞增殖的影響，進一步闡釋GDFG調節卵泡募集、保護卵巢儲備功能的作用機制。

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（收稿日期：2020-12-21 修回日期：2021-03-11）

（編輯：唐曉蓮）