芒果苷對胰島素抵抗HepG2細胞糖脂代謝的影響

黎梓霖 金惠杰 方佳 劉奕明 林愛華

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）09-1082-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.10

摘 要 目的：分析芒果苷（MGF）對胰島素抵抗HepG2細胞（IR-HepG2細胞）糖脂代謝的影響，并探討潛在機制。方法：以人肝癌HepG2細胞為對象，以1 mmol/L棕櫚酸+2 mmol/L油酸聯合培養建立IR-HepG2細胞模型。以鹽酸二甲雙胍為陽性對照，分別檢測低、中、高濃度MGF（125、250、500 μmol/L）作用24 h對IR-HepG2細胞中校正葡萄糖耗氧量和三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量的影響;采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術檢測細胞中腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路上游關鍵因子脂聯素（APN）、脂聯素受體2（AdipoR2）、APPL1、AMPK以及下游胰島素信號通路關鍵因子胰島素受體底物1（IRS-1）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖轉運體4（GLUT4）mRNA的相對表達量;采用Western blot法檢測AMPK蛋白的磷酸化水平。結果：與對照組比較，模型組細胞校正葡萄糖消耗量和APN、AdipoR2、APPL1、AMPK、IRS-1、GLUT4 mRNA的相對表達量以及AMPK蛋白磷酸化水平均顯著降低，TG、TC含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，各藥物組校正葡萄糖消耗量和APN（MGF中、高濃度組除外）、AdipoR2、APPL1、AMPK（MGF中、高濃度組除外）、IRS-1（MGF中、高濃度組除外）、Akt（陽性對照組除外）、GLUT4（MGF高濃度組除外）mRNA的相對表達量以及AMPK蛋白磷酸化水平均顯著升高，TG、TC含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：芒果苷可能通過激活通路上游靶點APN，進而調控AMPK信號通路，從而促進IR-HepG2細胞對葡萄糖的攝取，降低TG、TC含量，發揮改善胰島素抵抗及糖脂代謝異常狀態的作用。

關鍵詞 芒果苷;胰島素抵抗;人HepG2細胞;糖脂代謝;腺苷一磷酸活化蛋白激酶信號通路;脂聯素

Effects of Mangiferin on Glucose and Lipid Metabolism of Insulin-resistant HepG2 Cells

LI Zilin1，JIN Huijie1，FANG Jia1，LIU Yiming1，2，LIN Aihua3（1. Phase Ⅰ Clinical Trial Center， Guangdong Provincial Hospital of TCM/the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510120， China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Research on Traditional Chinese Medicine Syndrome， Guangdong Provincial Hospital of TCM/the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510120， China; 3. Dept. of Pharmacy， Guangdong Provincial Hospital of TCM/Zhuhai Hospital， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangdong Zhuhai 519000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To analyze the effects of mangiferin （MGF） on glucose and lipid metabolism in insulin resistance （IR） HepG2 cells， and to explore the potential mechanism. METHODS： Using human hepatoma HepG2 cells as research objects， 1 mmol/L palmitic acid and 2 mmol/L oleic acid were used to establish the IR-HepG2 cell model. Using metformin hydrochloride as positive control， the effects of low-concentration， medium-concentration and high-concentration MGF （125， 250， 500 μmol/L） on the corrected glucose consumption， the contents of triglyceride （TG） and total cholesterol （TC） in IR-HepG2 cells were detected. The mRNA expression of APN， AdipoR2， APPL1， AMPK in the upstream of AMPK signaling pathway and IRS-1， Akt and GLUT4 in the downstream insulin signaling pathway were detected by RT-PCR. The phosphorylation level of AMPK protein was detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with control group， corrected glucose consumption， mRNA expression of APN， AdipoR2， APPL1， AMPK， IRS-1 and GLUT4， as well as the phosphorylation level of AMPK protein were decreased significantly in model group， while the contents of TG and TC were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， corrected glucose consumption， mRNA expression of APN （except for MGF medium-concentration and high-concentration groups）， AdipoR2， APPL1， AMPK （except for MGF medium-concentration and high-concentration groups）， IRS-1（except for MGF medium-concentration and high-concentration groups）， Akt（except for positive control group）， GLUT4（except for MGF high-concentration group）were increased significantly in administration groups， while the contents of TG and TC were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Mangiferin may activate APN， which is the upstream target of pathway， and then regulate AMPK signaling pathway， so as to promote glucose uptake of IR-HepG2 cells， reduce TG and TC contents， and improve IR and abnormal glucose and lipid metabolism.

KEYWORDS ? Mangiferin; Insulin resistance; Human HepG2 cells; Glucose and lipid metabolism; AMPK signaling pathway; APN

2型糖尿病（T2DM）多由胰島素抵抗（IR）和B細胞功能障礙所致[1]，其中IR主要表現為肝臟、肌肉、脂肪等靶組織對胰島素的敏感性下降以及對葡萄糖的攝取及利用減少[2]。腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）分布于各組織中，其活化后能增加機體對胰島素的敏感性，改善IR和糖脂代謝紊亂，從而減輕T2DM相關癥狀[3]。有研究指出，脂聯素（APN）為AMPK信號通路的上游靶點，是該信號通路中的關鍵信號分子，可通過與脂聯素受體2（AdipoR2）結合而激活AMPK，而APPL1是AdipoR2與AMPK之間的關鍵銜接蛋白[4-5]。當AMPK被激活后，AMPK可進一步促進下游胰島素信號通路中胰島素受體底物1（IRS-1）的磷酸化，激活蛋白激酶B（Akt）;Akt活化可促使細胞中的葡萄糖轉運體4（GLUT4）由細胞質轉移到細胞膜，從而促進葡萄糖的攝取和利用，最終改善IR[6]。

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，其主要活性成分之一的芒果苷（MGF）具有改善IR和糖脂代謝紊亂的作用[7-8]，且這種作用與AMPK及其下游胰島素信號通路Akt和GLUT4的表達有關[9-10]。有研究表明，MGF能提升糖尿病IR模型大鼠血清中APN的含量[11]，但其是否能通過激活這一上游靶點進而調控AMPK信號通路中的各關鍵因子的表達，尚有待進一步探討。基于此，本研究以HepG2肝臟細胞IR模型（即IR-HepG2細胞模型）為對象，初步探討了MGF對其糖脂代謝以及AMPK信號通路的影響，旨在為MGF改善T2DM患者IR的作用機制研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括3111型CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Synergy H1型多功能酶標儀（美國BioTek公司）、HR40-ⅡA2型生物安全柜（廣州火元醫療器械有限公司）、AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Microfuge 16型臺式微量離心機和Allegra X-22R型多功能臺式冷凍離心機（美國Bechman Coulter公司）、7500型熒光定量基因擴增儀和Veriti型PCR逆轉錄儀（美國Applied Biosystems公司）、KS260型控制型搖床（德國KIA公司）、Min-protean Tetra型垂直電泳系統和ChemiDocTM型高靈敏度化學發光成像儀（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

MGF對照品（批號MUST-17040103，純度98.21%）購自成都曼斯特生物科技有限公司;鹽酸二甲雙胍對照品（陽性對照，批號100664-201805，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司;無脂肪酸牛血清白蛋白（BSA，批號WXBC0994V，純度99%）購自北京索萊寶科技有限公司;MTT試劑（批號QR14912）購自美國MP Biomedicals公司;二甲基亞砜（DMSO，批號RNBF2368）、棕櫚酸（PA，批號SLBW9894，純度98.5%）、油酸（OA，批號SLCC4023，純度99%）均購自美國Sigma公司;DMEM高糖培養基（批號8119081）、南美胎牛血清（批號2176398）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號15140122）、胰酶（批號2120649）均購自美國Gibco公司;葡萄糖氧化酶法檢測試劑盒（批號20180801137）購自南京建成生物工程研究所;三酰甘油（TG）試劑盒（批號E1003）、膽固醇（TC）試劑盒（批號E1005）均購自北京普利萊基因技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010）購自上海碧云天生物技術有限公司;彩色蛋白Marker（批號00784045）、5×十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號VG299802）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;TRIzol試劑（批號213506）購自美國Invitrogen公司;Fast Start Universal SYBR Green Master熒光定量試劑盒（批號04913914001）、Transcriptor cDNA Synth. Kit2反轉錄試劑盒（批號04897030001）均購自瑞士Roche公司;10×RIPA裂解液（批號75）、兔β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號4970）、兔AMPK單克隆抗體（批號2603）、兔磷酸化AMPK（p-AMPK）單克隆抗體（批號2535）均購自美國CST公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號SA00001-2）購自美國Proteintech公司;ECL發光液（批號1939801）購自美國Millipore公司;擴增引物由上海生工生物工程股份有限公司設計、合成;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人源HepG2細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞培養

HepG2細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基（以下簡稱“完全培養基”）中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養（以下培養條件相同），待細胞生長密度達80%左右時，用含0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化并傳代至新的培養皿中。

2.2 MGF藥液和新鮮培養基的配制

精密稱取MGF對照品適量，溶于DMSO中，制得濃度為250 mmol/L的MGF母液，分裝。臨用前，將上述母液用完全培養基稀釋至所需濃度。

取PA、OA適量，加水于75 ℃溶解后，趁熱與20%無脂肪酸BSA[以pH為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解]混勻并濾過。臨用前，用完全培養基稀釋成含3%BSA、1 mmol/L PA、2 mmol/L OA的新鮮培養基。

2.3 細胞分組與IR模型建立

取對數生長期的HepG2細胞適量，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（鹽酸二甲雙胍5 mmol/L，劑量設置參考文獻[12]并結合本課題組前期研究結果）和MGF高、中、低劑量組（500、250、125 μmol/L，劑量設置參考本課題組前期研究結果），每組設3個復孔。除正常組加入含3%BSA的完全培養基外，其余各組細胞均參照文獻[13]加入“2.2”項下新鮮培養基培養24 h以誘導建立IR模型。建模后，正常組、模型組和各藥物組分別替換為不含或含相應藥物的完全培養基繼續培養。

2.4 細胞葡萄糖消耗量檢測

取對數生長期的HepG2細胞適量，以3×104個/孔接種于96孔板中，按“2.3”項下方法分組、造模、給藥，同時設置不含細胞的空白對照組。各組細胞培養24 h后，取上清液，參照葡萄糖氧化酶法檢測試劑盒說明書方法，以多功能酶標儀檢測各孔的葡萄糖含量并計算葡萄糖消耗量：葡萄糖消耗量=空白對照組葡萄糖含量-待測組葡萄糖含量。棄去上清液后，各組細胞加入0.5 mg/mL的MTT試劑適量，于室溫下反應10 min，使用多功能酶標儀檢測各孔的光密度（OD）值，并計算細胞活力：細胞活力=（待測組細胞OD值-空白對照組OD值）/（正常組OD值-空白對照組OD值）。基于上述葡萄糖消耗量和細胞活力計算校正葡萄糖消耗量：校正葡萄糖消耗量=葡萄糖消耗量/細胞活力。實驗重復3次。

2.5 細胞中TG、TC含量檢測

取對數生長期的HepG2細胞適量，以1.2×105個/孔接種于6孔板中，按“2.3”項下方法分組、造模、給藥。各組細胞培養24 h后，棄去上清液，細胞用預冷PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液充分混勻，靜置10 min。收集各組細胞裂解液，于70 ℃加熱10 min，以2 000 r/min離心5 min，取上清液，參照相應檢測試劑盒說明書方法，以多功能酶標儀檢測各組細胞中TG、TC含量;同時，采用BCA法測定各孔的蛋白濃度，用于校正TG、TC含量。實驗重復3次。

2.6 細胞中AMPK信號通路各關鍵因子mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測AMPK信號通路上游關鍵因子APN、AdipoR2、APPL1、AMPK以及下游胰島素信號通路關鍵因子IRS-1、Akt、GLUT4的mRNA表達情況。取對數生長期的HepG2細胞適量，以1.2×105個/孔接種于6孔板中，按“2.3”項下方法分組、造模、給藥。各組細胞培養24 h后，棄去上清液，細胞經TRIzol法提取總RNA并根據Transcriptor cDNA Synth. Kit2試劑盒說明書方法逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，參照Fast Start Universal SYBR Green Master試劑盒說明書配制PCR擴增體系，混勻后，使用熒光定量基因擴增儀進行PCR擴增。反應體系（共20 μL）包括：cDNA模板2 μL，2×SYBR Green Ⅰ Master 10 μL，上、下游引物（其引物序列及產物大小見表1）各0.5 μL，ddH2O 7 μL。反應條件為：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法以QuantStudio 7 RT-PCR System（Version 1.1）軟件計算各目的基因mRNA的相對表達量，結果均以正常組為標準進行歸一化處理。實驗重復3次。

2.7 細胞中AMPK蛋白磷酸化水平檢測

采用Western blot法檢測。取對數生長期的HepG2細胞適量，以1.2×105個/孔接種于6孔板中，按“2.3”項下方法分組、造模、給藥。各組細胞培養24 h后，棄去上清液，細胞用預冷的RIPA裂解液充分裂解，收集裂解液，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液并采用BCA法測定蛋白濃度。根據蛋白濃度測定結果，加入5×SDS PAGE蛋白上樣緩沖液適量，于100 ℃煮沸變性10 min。取變性蛋白，進行10%SDS-PAGE分離后，以濕轉法轉膜，經5%BSA室溫封閉1 h;加入p-AMPK、AMPK一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000）和β-actin一抗（稀釋比例為1 ∶ 2 000），于4 ℃孵育過夜;用TBST溶液清洗10 min×3次，加入HRP標記的IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，經ECL發光液顯色后，使用高靈敏度化學發光成像儀曝光成像。采用Image Lab 5.2.1軟件對目的條帶進行灰度值分析，以p-AMPK與AMPK條帶灰度值的比值（即p-AMPK/AMPK比值）表示后者的磷酸化水平，結果均以正常組為標準進行歸一化處理。實驗重復3次。

2.8 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，采用Graph Pad Prism 7.0軟件作圖。數據均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗（方差齊）或Dunnetts T3檢驗（方差不齊）。P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 MGF對IR-HepG2細胞糖代謝的影響

與正常組比較，模型組細胞的校正葡萄糖消耗量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組細胞的校正葡萄糖消耗量均顯著升高（P<0.01），詳見表2。

3.2 MGF對IR-HepG2細胞脂代謝的影響

與正常組比較，模型組細胞內TG、TC含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組細胞內上述指標含量均顯著降低（P<0.01），詳見表2。

3.3 MGF對IR-HepG2細胞AMPK信號通路上游關鍵因子mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組細胞APN、AdipoR2、APPL1、AMPK mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和MGF低劑量組細胞APN、AMPK mRNA以及各藥物組AdipoR2、? ? ?APPL1 mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.4 MGF對IR-HepG2細胞AMPK下游胰島素信號通路關鍵因子mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組細胞中IRS-1、GLUT4 mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和MGF低劑量組細胞中IRS-1 mRNA，MGF各劑量組Akt mRNA，以及陽性對照組和MGF低、中劑量組GLUT4 mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.5 MGF對IR-HepG2細胞AMPK蛋白磷酸化水平的影響

與正常組比較，模型組細胞AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組細胞AMPK蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表5。

4 討論

T2DM是一種慢性代謝性疾病，被認為是全世界第五大死亡原因，其主要表現是患者糖脂代謝紊亂[14]。IR是T2DM發生的重要因素，其主要特征是胰島素作用的靶組織對葡萄糖的攝取和利用減少[2]。肝臟作為胰島素作用的主要靶組織，是維持糖脂代謝穩定的重要器官[2]。HepG2細胞為人肝癌細胞，由其構建的IR細胞模型是學界公認的可用于研究IR發生機制和降糖藥物作用機制的理想模型[15]，故本研究參考文獻[13]采用1 mmol/L PA+2 mmol/L OA聯合培養建立IR細胞模型。

本課題組前期研究表明，以DMSO作為溶劑，MGF最大溶解濃度為250 mmol/L，DMSO體積分數在0.2%（即500 μmol/L）以下對細胞毒性影響小;此外與正常組比較，MGF高、中、低劑量（500、250、125 μmol/L）對HepG2細胞的存活率均無顯著影響，且細胞存活率均在90%以上，故本研究選擇上述3個濃度進行后續實驗。結果顯示，MGF高、中、低劑量均可顯著提高IR-HepG2細胞的校正葡萄糖消耗量，其中以高劑量作用效果相對最強;同時，其還可顯著降低IR-HepG2細胞中TG、TC的含量，提示MGF可調整IR-HepG2細胞的糖脂代謝異常。值得注意的是，經MGF干預后，各劑量組細胞TG含量無明顯的劑量依賴趨勢，且從具體數據上看，MGF低劑量下調TG含量的效果較明顯。有研究指出，APN可降低肝臟組織中TG的含量并上調胰島素信號的轉導，提示TG含量與APN的表達水平有關[16]。經藥物干預后，MGF低劑量組細胞內APN mRNA的相對表達量更高，這可能是低劑量組細胞內TG含量更低的原因。

AMPK是一種細胞內能量感受器和調節因子，已被證明與IR、肝臟脂肪病變、糖尿病腎病及糖尿病心肌病的發生密切相關[17-19]。p-AMPK是AMPK的磷酸化形式，p-AMPK/AMPK比值能反映AMPK的活化程度;AMPK磷酸化的增加可有助于AMPK信號通路的激活，從而有利于抗IR作用的發揮[4]。有研究表明，MGF對糖脂代謝紊亂的調節作用與AMPK信號通路有關，但MGF不是該通路的直接激活劑，提示該化合物介導的AMPK激活可能與其上游關鍵因子有關[18-21]。APN是AMPK信號通路的上游靶點，其水平升高對T2DM、IR具有明顯的改善作用[16，22]。研究表明，APN缺乏會導致小鼠腦組織IR、認知功能減退和老年癡呆癥樣病變[23];另有研究表明，總APN水平與T2DM心血管風險有密切關聯[24]。可見，APN可以改善IR、增加機體對胰島素的敏感性。因此，研究MGF是否通過APN調節AMPK信號通路以改善糖脂代謝紊亂有重要意義。有研究指出，AdipoR2與IR相關的肝功能異常有關[25];此外，初診T2DM患者血清中APPL1水平異常升高，提示AdipoR2和APPL1均可能參與了T2DM的發生發展[26]。APPL1作為AdipoR2與AMPK之間的關鍵銜接蛋白，其表達量與APN介導AMPK磷酸化呈正相關[27]。活化的AMPK可激活下游胰島素信號轉導通路，促進糖脂代謝，最終改善IR[7]。IRS-1主要存在于胰島素敏感組織中，是介導胰島素及其功能的關鍵信號蛋白[28]。有研究表明，IRS-1與T2DM患者IR之間存在相關性，該因子異常表達可導致IR的發生，而IR又是T2DM的重要病理機制[29-30]。Akt是葡萄糖代謝中的關鍵酶，其可被胰島素激活，介導胰島素刺激的多種生物學效應[31]。GLUT4作為骨骼肌和脂肪細胞中的主要轉運蛋白，是Akt下游調控葡萄糖攝取的重要因子，可在胰島素的刺激下將葡萄糖轉運至胰島素敏感組織中以促進胰島素的利用，從而維持血糖的穩定和細胞正常的生理功能[32]。基于此，本研究對上述AMPK信號通路上、下游關鍵因子mRNA的表達進行了檢測。結果顯示，采用1 mmol/L PA聯合2 mmol/L OA誘導HepG2細胞，可導致IR的發生，并顯著下調AMPK信號通路中關鍵因子APN、AdipoR2、APPL1、IRS-1、GLUT4 mRNA的表達，以及AMPK蛋白的磷酸化水平，而不會顯著影響Akt mRNA的表達。經MGF干預24 h后，各藥物組細胞中上述關鍵因子的表達均不同程度地上調，其中APN、APPL1、AMPK、IRS-1、Akt、GLUT4 mRNA的相對表達量以及p-AMPK/AMPK比值均以低或低、中劑量組最優;而MGF各劑量組細胞中AdipoR2 mRNA的相對表達量并無明顯的量效關系，且均與陽性對照相當。有研究指出，AMPK為“細胞能量感受器”，細胞的能量狀況決定著AMPK的活化程度：APN會促進細胞腺苷三磷酸（ATP）的消耗，使細胞內ATP的含量降低、腺苷一磷酸的含量升高，可使AMPK通路被活化，以參與細胞能量代謝的調節[33]。相比于MGF高劑量組，MGF中、低劑量組細胞的校正葡萄糖消耗量相對較小，即能量攝入相對小，此時可能起到反饋調節作用，使得對應組細胞中APN的表達水平相對較高，提示此時AMPK通路被活化的可能性較高，從而增加了細胞內AMPK及其信號通路關鍵因子mRNA的表達。

綜上所述，MGF可能通過激活通路上游靶點APN，進而調控AMPK信號通路，從而促進IR-HepG2細胞對葡萄糖的攝取，降低細胞內TG、TC含量，發揮改善細胞IR及糖脂代謝異常狀態的作用。

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（收稿日期：2020-11-05 修回日期：2021-02-25）

（編輯：張元媛）