和胃理氣方對肝郁型功能性消化不良大鼠Ghrelin表達的影響

張鑫 劉陽 姜巍 王垂杰 李玉鋒

摘要：目的 研究肝郁型功能性消化不良大鼠胃排空率以及胃和下丘腦組織Ghrelin 蛋白的表達變化，以探究和胃理氣方對功能性消化不良干預的可能機制。方法 選取40只健康Wistar大鼠，雌雄各半，體質量（200±20）g，隨機分為空白組（10只）及模型組（30只）。空白組常規飼養，其余大鼠通過夾尾刺激法建立肝郁型FD大鼠模型，造模14 d。造模結束后按照隨機數字表分為模型組、嗎丁啉組、和胃理氣方組（每組10只）。期間監測大鼠進食以及毛發、行為等一般狀況。實驗結束后，測量各組大鼠胃排空率，并通過Western blot法測定胃組織以及下丘腦組織Ghrelin蛋白表達。結果 模型組胃排空率明顯低于和胃理氣方組、嗎丁啉組（P<0.05）;與模型組相比，和胃理氣方組和嗎丁啉組的胃及下丘腦Ghrelin蛋白表達增加（P<0.05）。結論 和胃理氣方可能通過上調Ghrelin蛋白表達來有效干預功能性消化不良。

關鍵詞：功能性消化不良;腦腸互動;胃;下丘腦;Ghrelin

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）04-0063-04

Effect of Hewei Liqi Decoction on Ghrelin Expression in Rats withLiver-Stagnation Type of Functional Dyspepsia

ZHANG Xin1， LIU Yang1， JIANG Wei2， WANG Chui-jie2， LI Yu-feng2

（1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China;2. The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China）

【Abstract】Objective： To study the gastric emptying rate and the expression changes of Ghrelin protein in stomach and hypothalamus in rats with liver-stagnation functional dyspepsia in order to explore the possible mechanism of Hewei Liqi decoction on functional dyspepsia. Methods： 40 healthy Wistar rats were selected， half male and half male， and weighed （200±20） g. They were randomly divided into a blank group （10） and a model group （30）. The blank group was bred routinely and the rest of the rats were used to create a liver depression type FD rat model by the tail-clamping method， and the model was established for 14 days. After modeling， the rats were divided into model group， domperidone group and Hewei Liqi Decoction group （10 each group） according to the random number table. During this period， the general conditions of the rats' food intake， hair， behavior， etc. were monitored. After the experiment， the gastric emptying rate of rats in each group was measured and the expression of Ghrelin protein in gastric tissue and hypothalamic tissue was determined by Western blot. Results： The gastric emptying rate of the model group was significantly lower than that of the Hewei Liqi Decoction group and the domperidone group（P<0.05）. Compared with that of the model group， the gastric and hypothalamic Ghrelin protein expression in the Hewei Liqi Decotion group and the domperidone group increased （P<0.05）. Conclusion： Hewei Liqi Decoction may effectively interfere with functional dyspepsia by up-regulating the expression of Ghrelin protein.

【Key words】Functional dyspepsia;Brain-intestine interaction;Stomach;Hypothalamus;Ghrelin

功能性消化不良（functional gastriointestinal disease，FD）是全球范圍內常見的功能性胃腸病之一，全球各國的消化不良患病率相差較大，總患病率約為11.5%～15.5%[1]。目前認為它是一種生物-心理-社會病癥，其病因和發病機制還不是十分清楚，多考慮與遺傳易感性、胃腸運動障礙、內臟敏感性增高、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染、中樞神經系統失調、黏膜免疫和炎癥反應、腦腸軸異常及精神-心理社會因素等有關[2]。近年來隨著對神經內分泌學說的深入研究，越來越多的學者認為腦腸軸在FD的發病中起著重要的作用[3]。由精神心理因素導致的FD患者除了有上腹部不適，早飽等胃腸道癥狀以外，還伴隨著不同程度的焦慮緊張，而腦腸肽在此過程中有至關重要的作用。Ghrelin，又稱促饑餓素或促生長素，是一種由28個氨基酸組成的內源性腦腸肽，是生長激素促分泌受體（GSHR）的天然內源性配體。主要由胃黏膜下層的 X/A 樣細胞分泌。Ghrelin在乙酰基轉移酶的作用下，變成有功能活性的酰基化Ghrelin，酰基化Ghrelin可通過血液及迷走神經，透過血腦屏障傳遞至下丘腦，與其受體GHSR-1a在弓狀核結合，激活下丘腦神經肽Y（NPY）和刺鼠相關蛋白（AgRP）神經元，從而促進胃腸運動，增加攝食行為。功能性消化不良的中醫病名對應“胃痛”、“胃痞”，其中肝郁型的發病過程與腦腸互動相對應[4]，肝失疏泄，情志不暢，憂思傷脾，導致脾運化不利，胃失和降而痞滿。本實驗旨在通過檢測和胃理氣方對FD大鼠模型的胃排空率及胃和下丘腦組織中Ghrelin的表達結果，探討其對FD治療作用機制，為以后臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取40只健康Wistar大鼠，雌雄各半，體質量（200± 20）g，隨機分為空白組（10只）及模型組（30只）。

1.2 藥物 和胃理氣方：柴胡 15 g，黨參 20 g，枳實 12 g，木 香 6 g，厚樸 12 g，陳皮 12 g，豆蔻 9 g，甘草 12 g。濃縮至每毫升相當于生藥1 g;嗎丁啉：以蒸餾水配制成 0.25 mg/mL的混懸液備用;生理鹽水。

1.3 主要試劑 RIPA裂解液（強）：碧云天（貨號P0013B）;5×蛋白電泳上樣緩沖液：鼎國（貨號WB-0091）;Bradford蛋白濃度測定試劑盒：碧云天（貨號P0006）;蛋白預染marker：Bio-rad（貨號161-0363）;SDS-PAGE凝膠配置試劑盒：碧云天（貨號P0012A）;PVDF膜：Bio-rad（貨號162-0177）;ECL顯色液：Bio-rad（貨號170-5060）;Ghrelin抗體：proteintech（貨號13309-1-AP）;二抗（鼠）：CST（貨號7076s）;二抗（兔）：CST（貨號7074s）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備及分組 空白組常規飼養，模型組參照文獻采用郭氏夾尾激怒法制備FD肝胃不和模型。每日2次，連續刺激14 d。每天夾尾時間固定[5]。造模結束后按照隨機數字表分為模型組、嗎丁啉組、和胃理氣方組（每組10只）。

1.4.2 給藥方法 造模結束日起開始給藥。按藥理學實驗方法計算給藥劑量，和胃理氣方組給予和胃理氣方40 g/kg/d（即4mL/100 g），嗎丁啉組給予已配制的嗎丁啉懸濁液0.01 g/kg/d（即0.001/100 g），空白對照組及模型組以等體積生理鹽水灌胃。每日給藥2次，連續14 d。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 實驗期間每天觀察大鼠的進食進水量，毛發，行為等變化。

1.5.2 檢測大鼠胃排空率 各組動物用藥結束時，禁食1 d，第2 d以10%酚紅溶液灌胃，20 min后處死，剖腹、結扎賁門和幽門。取胃，沿胃大彎側切開，以蒸餾水沖洗胃內容物，定容為6mL，加入0.15 mol/L的Ba（OH）2溶液2 mL攪拌混勻，靜置10 min，再加入5%ZnSO4溶液2 mL振蕩5 min，以3000 r/min離心10 min。吸取上清液4 mL，再加10%NaOH溶液0.5 mL混合，用分光光度計在560 nm波長下測定吸光度值（試驗組A560），再測0.4%酚紅溶液1 mL+1 mL蒸餾水+10%NaOH溶液0.5 mL的吸光度值（標準A560）。胃排空率計算公式：胃排空率（%）=（試驗組A560-標準A560）/試驗組A560*100%

1.5.3 Western blot法檢測胃竇及下丘腦組織中Ghrelin表達 末次給藥結束后24h禁食不禁水，斷頸處死后暴露腹部，于無菌環境下取胃竇部組織及下丘腦組織，于-80℃保存。通過蛋白印跡法（Western blot）測定Ghrelin蛋白表達。使用Quantity One軟件檢測蛋白條帶的灰度值，每個樣品的目的條帶灰度值與內參灰度值進行比較，然后再進行組間比較，最后得出目的蛋白的表達水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS 23.0 統計軟件分析數據。計量資料以（x±s）表示。所有相關數據均作方差齊性檢驗和正態性檢驗，采用單因素方差分析和χ2檢驗，組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般狀況 空白組大鼠一般狀態良好，毛發光澤，活動靈敏，進食正常，大便呈球狀。模型組大鼠進食明顯減少，毛發變暗、枯黃、不順，并有緊張、焦慮。和胃理氣方組和嗎丁啉組在治療過程中，毛發漸漸恢復光澤，進食量和進水量逐漸增加，體質量均逐漸回升，和胃理氣方組大鼠效果更明顯。

2.2 和胃理氣方對大鼠胃排空功能的影響 模型組大鼠胃排空率顯著低于空白組;和胃理氣方組和嗎丁啉組大鼠胃排空率顯著高于模型組;和胃理氣方組大鼠胃排空率相比嗎丁啉組更高（P<0.05）。見圖1

2.3 各組大鼠胃黏膜組織Ghrelin蛋白表達比較 與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織Ghrelin蛋白表達水平顯著降低，與模型組比較，和胃理氣方組、嗎丁啉組大鼠胃黏膜組織Ghrelin蛋白表達水平顯著升高。與嗎丁啉組比較，和胃理氣方組無明顯差異（P>0.05），見表1。

2.4 各組大鼠下丘腦組織Ghrelin蛋白表達比較 模型組大鼠下丘腦中 Ghrelin 蛋白表達明顯低于正常組，和胃理氣方組和嗎丁啉組均可不程度地升高FD大鼠下丘腦中Ghrelin的含量，和胃理氣方組稍高于嗎丁啉組，見表1。

3 討論

現在精神心理因素導致的FD已經引起廣泛重視，而腦腸肽在此過程中具有重要作用。有大量研究表明Ghrelin具有促進食欲的作用。毛蘭芳等[6]研究發現腦腸肽水平變化是引起胃腸動力障礙的最主要因素之一。陳蘇寧等[7]研究證實 FD患者可能存在Ghrelin分泌異常，促胃動力藥可能通過改變Ghrelin水平來促進胃腸運動。林亞平等[8]研究表示電針針刺“足三里”促進糖尿病胃輕癱大鼠胃腸運動的作用機制可能與上調ghrelin的表達有關，說明外治法也可以使體內ghrelin含量變化。同時也有研究表示抑郁模型大鼠體內ghrelin 水平的異常升高，可能是對應激的一種反應，或許與 ghrelin 調控HPA軸相關[9]。薛香莉等[10]研究表示，ghrelin與GHSR結合可以產生抗抑郁效應，注射適宜劑量Ghrelin可產生抗焦慮行為。而Kazemi等[11]研究表明發現隨著進食的時間變化，體內Ghrelin的含量也發生著動態變化，而Ghrelin與疾病狀態之間的正相關或負相關取決于不同的測定方法以及是否排除了體內基礎Ghrelin含量。另有國外學者研究表明，Ghrelin還能降低血清中內源性配體高遷移率族蛋白 1（HMGB1）水平并且改善腸黏膜屏障功能，通過刺激迷走神經減少腸道缺血-再灌注損傷。

本實驗參照郭氏夾尾激怒法進行造模，在造模第四天大鼠進食明顯減少，毛發變暗、枯黃，并有緊張、焦慮，提示造模成功。在給予和胃理氣方和嗎丁啉治療后對比發現，模型組大鼠存在胃動力障礙和焦慮，和胃理氣方組及嗎丁啉藥組能夠加快FD大鼠的胃排空，提高胃竇組織及下丘腦組織Ghrelin的表達。本研究進一步證明Ghrelin的水平在FD 的發病中起重要作用。進一步推測和胃理氣方對FD的治療作用是通過增強胃動力、改善腦腸肽Ghrelin的正常分泌而實現的。然而影響Ghrelin表達的因素很多，包括饑餓、應激、血糖變化及機體其他激素的分泌等。本研究僅從大鼠胃排空功能和Ghrelin蛋白在胃竇及下丘腦表達水平探討和胃理氣方對FD的治療機制，而是否有其他機制來改善肝郁型FD大鼠的癥狀還需要進行進一步實驗研究。

《景岳全書·痞滿》記載：“痞者，痞塞不開之謂;滿者，脹滿不行之謂。”指出“怒氣暴傷，肝氣未平而痞”。意為情志失調，氣機郁滯，肝失疏泄，脾胃升降失調而為痞滿。本課題組前期實驗證實FD肝郁型發病過程中腦腸互動為重要環節[4]。治療當以疏肝理氣和胃。和胃理氣方中柴胡用量大取其疏肝解郁之用，現代研究表示，柴胡有促進小腸推進的功能[12]。

黨參補中益氣，健脾生津，與柴胡配伍共為君藥;枳實厚樸為行氣消脹常用的對藥，現代藥理學證實厚樸中的酚類及枳實中的黃酮類物質都能不同程度促進胃排空。劉元素稱木香散滯氣，調諸氣，和胃氣。現代研究表明木香中木香烴內酯和去氫木香內酯可加速胃排空和增強胃動素的釋放[13]。豆蔻化濕行氣，溫中止嘔，右旋龍腦和右旋樟腦為其主要揮發油成分，可促進胃液分泌，促進胃腸蠕動。陳皮理氣燥濕，健脾和胃，為脾胃之圣藥;此五味藥共為臣藥。甘草益氣健脾，緩急，調和諸藥，緩諸藥之峻猛，健脾胃之氣，為佐使藥。八味藥共同達到疏肝理氣，健脾除滿之功效。

綜上，本實驗通過檢測大鼠腦腸肽Ghrelin在下丘腦及胃組織的表達以及胃排空功能探討了和胃理氣方治療肝郁型FD的機制，可以合理推測和胃理氣方可能通過上調體內Ghrelin蛋白的表達，來調節肝郁型FD大鼠胃腸運動障礙及焦慮狀態，從而發揮治療FD的作用，為中醫藥治療FD提供有效依據。

參考文獻：

[1]吳柏瑤，張法燦，梁列新.功能性消化不良的流行病學[J].胃腸病學和肝病學雜志，2013，22（1）：85-90.

[2]毛蘭芳，汪龍德，張宏偉，等.功能性消化不良與腦腸肽的研究進展[J].世界華人消化雜志，2015（4）：570-576.

[3]劉未艾，劉密，何亞敏，等.功能性胃腸病腦腸肽的研究進展[J].中國中醫急癥，2012，21（6）：951-953.

[4]姜巍，王垂杰.肝郁型功能性消化不良大鼠胃腸運動障礙與胃腸激素關系的研究[J].遼寧中醫雜志，2016，43（2）：408-409.

[5]郭海軍，林潔，李國成，等.功能性消化不良的動物模型研究%The Animal Model Study of Functional Dyspepsia[J].中國中西醫結合消化雜志，2001，9（3）：141-142.

[6]毛蘭芳，汪龍德，張宏偉，等.功能性消化不良與腦腸肽的研究進展[J].世界華人消化雜志，2015（4）：570-576.

[7]陳蘇寧，禮海，史業東.胃痛消痞方對功能性消化不良大鼠血清及胃組織中Ghrelin、Leptin的影響[J].世界華人消化雜志，2010（26）：77-80.

[8]林亞平，萬全荃，彭艷，等.電針對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇促生長素mRNA、生長激素促分泌素受體mRNA表達的影響[J].針刺研究，2015，40（4）：290-295.

[9]徐月妹，張嵐，肖茜，等.919糖漿對肝郁氣滯血瘀證模型大鼠腦胃ghrelin通路的影響[J].上海中醫藥雜志，2019，53（5）：82-89.

[10]薛香莉，劉微娜，漆正堂，等.基于“腦-腸互動”理論探究腦腸肽在運動抗抑郁中的作用機制[J].體育科學，2019，39（12）：76-85.

[11]Kazemi M，Eshraghian A，Hamidpour L，TaghaviS.Changes in serum ghrelin level in relation to meal-time in patients with functional dyspepsia[J].United European Gastroenterol，2015，3：11-16.

[12]劉莎.柴胡疏肝散治療功能性消化不良隨機平行對照研究[J].實用中醫內科雜志，2017（3）：35-37.

[13]魏華，彭勇，馬國需，等.木香有效成分及藥理作用研究進展[J].中草藥，2012，43（3）：613-620.

（收稿日期：2020-11-09）