獼猴桃潰瘍病枝條揮發物的GC-MS分析

周良強 汪洋 張景榮 陳莉 唐立忠 李臻 卓明 黃昭賢

摘 要 為了研究獼猴桃感染潰瘍病后枝條揮發物的組分特征，給探索獼猴桃潰瘍病的病理和抗性機制提供參考，應用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術鑒定健康枝條和感病枝條揮發物的化學成分，采用離子流峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。結果：從獼猴桃健康和感病枝條的揮發物中分別鑒定出73 和 67個揮發性化合物，合計81種成分，二者相同組分59個，包括烷烴類、烯烴類、醇類、酚類、醛類、酮類、苯環類化合物、雜環類化合物、呋喃類和含氮化合物，其中烷烴類化合物和苯環類化合物為獼猴桃枝條的主要成分。進一步比較發現，感病枝條中含有2-乙基甲苯、2，3，5，6-四甲基苯酚等8種特有物質，且4-乙基甲苯、十八烷等物質比健康枝條含量明顯降低。

關鍵詞 獼猴桃潰瘍病;枝條;揮發物;GC-MS分析

中圖分類號：S436.634 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.10.001

獼猴桃（Actinidia Lindl.）富含多種氨基酸、礦物質和維生素C，具有較高的營養價值與保健功效，現已成為許多地區的經濟支柱產業[1-3]。獼猴桃果肉顏色多樣，其中，紅心獼猴桃口感佳、色彩美，頗受消費者青睞。自1997年世界上首個紅心獼猴桃品種——中華獼猴桃‘紅陽育成以來，紅肉品種的選育成為了研究熱點。爾后，以‘紅陽獼猴桃為材料選育出一系列紅肉新品種，如‘紅華‘晚紅‘東紅‘紅什1號 [4-7]，已作為我國獼猴桃育種中最主要的骨干親本[8]。紅心類型的獼猴桃品種，雖然其食用品質優異，但大多對潰瘍病敏感[9]，目前，主流學者認為該病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae，Psa）引起。獼猴桃潰瘍病具有傳播快、致病力強、難治愈等特點，是一種毀滅性的病害，可導致短期內大面積植株死亡，給生產造成重大經濟損失[10]。四川是全國獼猴桃主要產區之一，近年全省獼猴桃種植面積逐年增加，產量位居全國前列，其中，紅心獼猴桃產量占全國紅心獼猴桃的90%以上[11]。獼猴桃潰瘍病在四川省各大栽培區均有發現，近年來呈現逐步蔓延、病情不斷加重的趨勢。以往對獼猴桃潰瘍病的研究多側重于防治策略，包括農業防治、化學防治和生物防治方法[12-13]。最近，李亞巍等對該病菌在田間感病獼猴桃植株上的分布情況及侵染后的傳播規律進行了報道[14];李靖等鑒定了四川主栽獼猴桃品種對潰瘍病的抵抗能力[15]。

獼猴桃潰瘍病會導致植株產生抗感生理反應，引起體內代謝產物的變化。迄今對獼猴桃組織中揮發性病理產物的研究尚未見報道。本研究運用氣相色譜-質譜聯用儀（GC/MS System）分別分析了‘紅陽獼猴桃健康植株枝條與感潰瘍病枝條的韌皮部、木質部及髓心組織中揮發性次生代謝產物的種類和含量差異，旨在為探索獼猴桃潰瘍病的病理和抗性機制提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

2020年3—5月，值獼猴桃潰瘍病高發期，分別于雅安市的名山區、雨城區、蘆山縣采集‘紅陽獼猴桃感病枝條;在成都雙流一個9年未發生潰瘍病的獼猴桃園區采集健康枝條。采后，先用超純水洗去枝條表面的灰塵和雜質，待晾干后在健康和染病枝條部位分離出韌皮部、木質部、髓部三類組織，染病枝條在節間處病斑取樣，對照選取與感病枝條同等枝齡和粗度的健康枝條。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 樣品處理

每個樣品取0.2 g放入裝有吸附劑PorapakQ80/100的提取管中，密閉吸附48 h后，去除樣品，加入適量正己烷浸泡30 min。取上清液再經微孔過濾膜過濾后置于進樣瓶中待測。

1.2.2? 揮發物檢測

采用安捷倫7890B-7000D氣相色譜-三重四級桿質譜聯用儀，色譜柱為HP-5MS （30 m×250 μm×0.25 μm），進樣量為1 μL，升溫程序為40 ℃保持3 min，之后以每分鐘上升6 ℃到280 ℃，保持3 min，最后以每分鐘上升6 ℃到310 ℃，保持10 min。載氣為高純氦氣。離子源溫度為280 ℃，質譜掃描范圍m/z為50～500。

1.2.3? 揮發物定性與半定量

根據GC/MS總離子圖，對各色譜峰對應的質譜圖進行解析，通過檢索比對標準質譜圖譜數據庫（NIST14），并結合匹配分數、各成分的保留時間、質譜裂片圖及文獻查對，鑒定其化學成分。采用離子流峰面積歸一化法計算各揮發物組分的相對含量。

2? 結果與分析

2.1? 健康和潰瘍病獼猴桃枝條揮發物總離子流圖

通過動態頂空吸附法+氣相色譜-質譜法分離到多種化學成分，得到健康和潰瘍病獼猴桃枝條的韌皮組織、木質組織和髓心樣品揮發物成分檢測的總離子流圖（見圖1、圖2）。

通過CAS號檢索和文獻核對，在健康枝條和潰瘍病枝條的韌皮組織、木質組織和髓心中共鑒定出81個化合物（見表1），其中苯環類化合物25個、烷烴類23個、烯烴類11個、醇類4個、酚類4個、酯類3個、呋喃類3個、雜環類化合物2個、酮類2個、醛類2個，含氮和含碘化合物各1個。按離子流峰面積歸一化計算各揮發物組分的相對含量，結果顯示在健康和感病枝條的韌皮組織、木質組織和髓心中，均以1，2-二乙苯含量最高，達65%以上。

2.2? 健康與感病枝條揮發性化合物組分差異

由表1可知，健康枝條與感病枝條3種不同組織的化學成分組成存在明顯差異的有22個，包括苯環類化合物、醇類、酚類、烷烴類、烯烴類，其中，4-丙基甲苯（C10H14）、1-丁烷-2-基-2，4-二甲基苯（C12H18）、香芹酚（C10H14O）、乙酸橙花叔醇酯（C17H28O2）、柏木腦（C15H26O）和3，4-環氧四氫呋喃（C20H30O4）等14個成分僅存在于健康獼猴桃枝條中，而2-乙基甲苯（C9H12）、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯（C10H12）、5-甲基-2，3-二氫-1H-茚（C10H12）、2，3，5，6-四甲基苯酚（C10H14O）和2，6，11，15-四甲基十六烷（C20H42）等8個化合物僅存在于潰瘍病獼猴桃枝條中。

2.3? 健康與感病枝條揮發性化合物相同組分含量變化

健康獼猴桃枝條與潰瘍病獼猴桃枝條共有59個相同揮發性化合物，其中有些成分的含量在二者中存在較大的差異。與健康枝條相比，在感病枝條中，對二乙基苯（C10H14）含量大幅增高，而4-乙基甲苯（C9H12）、3-乙基苯甲醛（C10H12）、4-異丙基苯甲醇（C10H14O）、正十七烷（C17H36）和正十八烷（C18H38）等含量明顯降低。

3? 結論與討論

本研究采用頂空固相微萃取與氣質聯用（GC-MS）的方法，分析了獼猴桃健康和感潰瘍病枝條揮發物的成分。從健康和感病枝條中，共測定出苯乙烯（C8H8）、正丙基苯（C9H12）、油酸酰胺（C18H35NO）等81種揮發物組分，結果表明健康和感潰瘍病獼猴桃枝條揮發物的主要成分為1，2-二乙苯（C10H14）、2，4-二甲基苯乙烯（C10H12）和對乙基苯乙酮（C10H12O），二者揮發性化學物種類差異較大，且部分相同化合物的含量也存在明顯差異。在枝條的木質組織中，揮發物中的萘（C10H12）、油酸酰胺（C18H35NO）和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（C15H24O）3種物質含量感病枝比健康枝低，感病枝分別為健康枝的23%、19%和16%。而2-乙基甲苯（C9H12）、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯（C10H12）、2，3，5，6-四甲基苯酚（C10H14O）、5-甲基-2，3-二氫-1H-茚（C10H12）等8個化合物僅在感病枝中檢測出。由此可見，獼猴桃枝條感染潰瘍病后其揮發物的含量發生了明顯的變化。有研究表明，植物受到病蟲害的侵害時，會產生許多次生代謝物質來進行調節，以抵抗病蟲害的侵襲[16]。

關于獼猴桃潰瘍病的致病機制，普遍認為是丁香假單孢細菌感染所致。而本研究中，在染病枝條中還發現真菌侵染。本文發現的差異揮發物可能是獼猴桃在遭受病原侵害后的病理代謝產生，也可能由病原代謝的合成或降解所產生。有研究者在感病枝條中普遍發現小蠹蟲，從而認為該病害是由小蠹蟲為害引起[17]。大量的研究證實，植物揮發物對昆蟲產生引誘或驅避作用[18-20]。本研究中，感染潰瘍病后枝條的特有揮發物質，也可能與植物驅避小蠹蟲等昆蟲的生理生化作用有關。有關上述問題的科學解答，還需要進一步研究。

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（責任編輯：丁志祥）