雞β-防御素5在大腸桿菌中的串聯表達及生物學活性檢測

溫鈺蓉，尹姣姣，田文霞，馬海利，高榮琨，張 鼎，李 楨，喬夢麗，王 穎，寧官保

（山西農業大學動物醫學學院，山西太谷030801）

防御素是一類主要表達于中性粒細胞和上皮細胞的抗菌肽家族，它在天然免疫和天然免疫之外的生物學功能、結構與活性的關系、作用機制和治療潛力一直是人們感興趣的研究課題。一個防御素分子中，含有6～8個半胱氨酸殘基，其中形成3～4對分子內的二硫鍵。根據半胱氨酸殘留物的序列同源性和連通性的不同，故有植物防御素、昆蟲防御素、α-防御素、β-防御素和θ-防御素之分[1]。目前為止，共發現14種防御素。近年來，關于這14種雞防御素及其應用一直為研究熱點，但防御素存在以下問題：（1）分子小，易被蛋白酶降解；（2）作為小分子物質，其分離純化較困難；（3）禽類動物體內含量較少，化學合成成本較高[2-3]，而利用基因工程技術，可使其在微生物體內直接表達，提高生產效率，降低成本；（4）與傳統的抗生素相比，某些防御素的活性尚不理想，改造設計防御素分子是提高其活性的有效途徑，這就需要進一步改良防御素。針對防御素天然含量低的問題，基因串聯表達技術能夠在基因層面有效解決此問題[4-7]，此技術有利于小分子肽的表達和防御素的工業化產出。防御素屬于抗菌肽中的一類陽離子多肽，對動物體本身有著天然免疫作用[8-9]。雞β-防御素最早由HARWIG等[10]從雞嗜中性粒細胞中發現得到，并對發現的防御素分別命名為Gal-1、Gal-1α、Gal-2、Gal-3。

雞體內分布有14種β-防御素[11-13]，若能解決其天然含量較低的問題，實現在體外可大量表達的愿望，不僅能夠使因抗生素的濫用導致細菌不斷產生耐藥性不再是問題，而且對于社會來說增添了很大的效益。國內外學者研究表明，在特定工程菌內基因工程技術可生產大量天然防御素[14-18]。基因工程技術先進，易于操作，能提高蛋白表達量，使防御素表達效率較高，并且成本較低。王婷婷等[19]在對抗菌肽基因同向串聯表達載體的研究中，探討了一種構建多拷貝基因串聯體的方法。對于小分子多肽等單拷貝蛋白表達量不高的基因，基因工程技術可以有效解決此問題。基因串聯表達技術采用串聯小分子多肽基因序列的方式構建重組表達載體，提高了防御素的分子質量并且增加了蛋白表達量，故本試驗采用串聯表達技術提升雞β-防御素5（AvBD-5，又稱Gal-5）蛋白表達量，并分析其生物學活性。

本試驗通過串聯表達的方法得到2×Gal-5基因，并將目的基因與pET-28a表達載體連接，轉化到BL21中進行誘導表達蛋白，經鑒定得到pET-28a-2×Gal-5蛋白，并進行生物學活性檢測，旨在為后續動物試驗及家禽疾病的研究提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因工程菌BL21 基因工程菌BL21由山西農業大學動物醫學學院生物制品實驗室保存，pET-28a載體質粒系統為全式金公司產品。

1.1.2 酶類及其他試劑 限制性內切酶Eco R I、Nde I和T4L連接酶均購自Takara公司；PR1900蛋白Marker、HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自北京索萊寶科技公司；質粒小提（中量）試劑盒購自天根生化科技有限公司；Anti-6×His抗體購自Abcam公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR引物設計與合成 采用DNAstar軟件設計的引物送至上海生工生物工程股份有限公司合成。引物為Gal-5-1：GACACGACACCATATGCG CCCTCTGCCACTTGATTGTG；Gal-5-2：GTGTCCTC GAGTTACCTTTACCAGCGAGAACCCCA。

本試驗以2×Gal-5-1、2×Gal-5-2為上下游引物擴增成熟肽段，引物中下劃線部分分別為加入的限制性酶切位點Nde I和Eco R I，方便表達載體的構建。

1.2.2 2 ×Gal-5串聯基因的擴增 按照NCBI上雞AvBD-5的cDNA編碼區序列（登錄號：AY621307），優化序列后將其進行2次串聯的基因序列為：CATATGCGCGGGTTGCCCCAAGATTGCGAACGTC GCGGTGGCTTCTGCTCACATAAATCGTGTCCGCCT GGAATCGGGCGCATCGGATTATGTAGCAAAGAGG ACTTTTGTTGTCGCTCCCGCTGGTATTCTGGAGGC GGAGGTAGCGGTGGTGGCGGATCTCGCGGGCTTC CACAGGACTGTGAGCGCCGTGGAGGGTTTTGTAG TCATAAGTCATGTCCTCCCGGTATCGGACGTATCG GCCTTTGTTCGAAAGAGGATTTTTGCTGTCGCAGC CGTTGGTATTCATAACTCGAG。上述序列中下劃線為Nde I和Eco R I酶切位點，交由上海生工有限公司合成基因序列。以2×Gal-5序列DNA為模板，擴增片段長度約為297 bp，反應體系為：10×PFU緩沖液和dNTP各5μL，模板1μL，上游引物Gal-5-1、下游引物Gal-5-2各0.5μL，PFU 0.4μL，加水至50μL。擴增條件：95℃，3 min；95℃，22 s，55℃，22 s，72℃，30 s，24個循環；72℃，5 min。

1.2.3 pET-28a-2×Gal-5表達載體的構建 按照質粒小提（中量）試劑盒說明書進行pET-28a質粒的提取后，采用限制性內切酶Nde I、Eco R I對純化回收后的PCR產物和pET-28a載體進行雙酶切。以2×Gal-5目的基因和pET-28a載體的摩爾比為3∶1進行連接，通過菌液PCR和雙酶切鑒定重組質粒，并送至上海生工測定DNA序列。測序正確后將連接產物按常規方法轉化進感受態細胞BL21中。

1.2.4 重組質粒的誘導表達 使用一次性接種環挑取轉化后的單菌落于5 mL液體LB培養基（含30μg/mL卡那霉素）中，37℃，220 r/min培養過夜；之后吸取1 mL菌液加入10 mL LB液體培養基（含30μg/mL卡那霉素）中，并在相同培養條件下培養；當OD600值達到0.6時，加入IPTG，在20、37℃的環境下各誘導12 h。

1.2.5 表達產物的鑒定 在誘導表達12 h后，以5000 r/min的轉速離心20 min后將上清棄掉，取沉淀用PBS重懸后進行超聲波破碎，之后以5000 r/min的轉速離心15 min，取不同環境下誘導管中的上清和沉淀，加入4×Protein Loading Buffer上樣緩沖液后沸水中放置10 min；將處理過的樣品做SDS-PAGE蛋白電泳，未加IPTG誘導的菌液作為陰性對照。

1.2.6 2 ×Gal-5重組蛋白的純化 鑒定重組蛋白表達主要以包涵體形式存在，將包涵體洗滌液Ⅰ重懸菌體沉淀，收集懸浮液于預冷的燒杯中，4℃攪拌洗滌2 h后10000 r/min離心20 min，用洗滌液Ⅱ、Ⅲ和包涵體溶解液重懸，操作同洗滌液Ⅰ，待溶解液溶解2 h之后收集裂解液上清即為重組蛋白釋放液。

1.2.7 原核重組蛋白的復性 將純化后的蛋白置于透析袋中復性。透析液為尿素，尿素濃度依次為6、4、2、0 mol/L的PBS溶液，每隔2 h換液一次，最后再用PBS透析過夜。將所得到的蛋白液收集，測定蛋白濃度，-80℃冰箱保存。

1.2.8 抑菌試驗 取出純化后的蛋白5 mL（質量濃度為0.1μg/μL），1 mL用PBS稀釋至0.05μg/μL，4 mL蛋白濃縮至質量濃度為0.2μg/μL；將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌4種菌均勻涂布在營養瓊脂培養皿上，垂直放置牛津杯在平板表面，并向其加入200μL純化好的蛋白，12 h后觀察抗菌情況，抗菌結果應同PBS組作對照，若隨著蛋白濃度的提高，抑菌圈逐漸擴大，說明抗菌情況較好。

2 結果與分析

2.1 2×Gal-5串聯基因的擴增結果

以Gal-5-1和Gal-5-2為引物，2×Gal-5為模板，擴增產物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果在300 bp處出現1條預期大小的條帶（圖1），表明已成功擴增出2×Gal-5成熟肽基因片段。

2.2 重組表達載體pET-28a-2×Gal-5鑒定結果

將2×Gal-5插入到原核表達載體pET-28a中，獲得重組質粒pET-28a-2×Gal-5，經Nde I和Eco R I雙酶切鑒定，目的基因2×Gal-5已正確插入到pET-28a的Nde I/Eco R I位點（圖2）。測序結果證實目的基因2×Gal-5成功重組到pET-28a表達載體中。

2.3 重組2×Gal-5蛋白表達結果

經SDS-PAGE分析，重組質粒pET-28a-2×Gal-5表達出了約為12 ku的2×Gal-5重組蛋白，與預期相符，且在20、37℃環境條件下誘導時發現，20℃時誘導表達產物更多（圖3）。Western Blot分析發現，大多數蛋白以包涵體形式存在，并且20℃環境下誘導出的蛋白含量比37℃環境下高（圖4）。

2.4 重組2×Gal-5蛋白的純化結果與分析

融合蛋白經過純化，SDS-PAGE和Western Blot凝膠電泳分析，在相應位置均出現明顯條帶，表明融合蛋白純化成功（圖5、6）。

2.5 抑菌試驗結果

抑菌結果顯示（圖7），不同濃度2×Gal-5蛋白對大腸桿菌抑菌時，抑菌圈直徑的平均值分別為0、7.50、15.50、22.00mm。

3 結論與討論

目前Gal-5、Gal-9、Gal-12、Gal-13在大腸桿菌中表達出的蛋白均以包涵體形式出現[20-24]。本試驗研究的雞β-防御素5常規表達量較低，采用串聯表達技術將2×Gal-5串聯其基因序列，增加其分子質量后對其誘導表達，可形成一個相對穩定的蛋白[18]，試驗在20、37℃環境下分別誘導，經檢測在20℃環境下誘導蛋白的表達量有一定的提高，若試驗過程中對誘導時間進行優化應該會達到更理想的效果。純化重組蛋白后測定其蛋白質量濃度為0.1μg/μL，后進行了抑菌試驗的初步摸索，表現出雞β-防御素5對4種指示菌的抑菌活性[25]。同PBS組對比，隨著蛋白濃度的成倍增加，抑菌范圍不斷擴大，說明該蛋白對大腸桿菌的抗菌效果明顯。

基因串聯表達技術是基因工程技術中最基本的一項技術，有其自身特殊性所在，在表達小分子肽時具有非常突出的優勢，能夠克服小分子肽在體外表達產量低的問題，在蛋白質表達中發揮了重要的作用，目前已被廣泛研究和應用[26]。本試驗采用串聯表達技術串聯2個小肽基因序列，提高了分子質量并且增加了蛋白表達量。在基因序列的串聯方式的選擇上，反向串聯會破壞其重組表達載體的穩定性，降低其蛋白表達量，所以，在本試驗中為避免該問題，采用同向串聯的方式[27-29]串聯AvBD-5目的基因，能夠有效提升2×Gal-5表達量及穩定性。

綜上所述，很多利用大腸桿菌表達的抗菌肽，如2×β-防御素2和3×β-防御素130，在前人試驗進展中將其培養條件不斷摸索，不僅成功表達蛋白而且將其產量顯著提升，達到了串聯表達的目的。而且利用大腸桿菌表達系統生產其防御素，使其表達效率增高，成本降低，表明了大腸桿菌表達系統十分適合生產AvBD-5。與哺乳動物細胞相比，基因連接表達載體轉入大腸桿菌后誘導表達使蛋白表達效率可以高出好幾倍，其生長速度較快以及培養時所需的成本低，同時獲得蛋白活性較高，產量大，穩定性好[29-33]。根據大腸桿菌表達雞AvBD-5抗菌活性試驗可以得出，大腸桿菌對革蘭氏陰性菌的抗菌活性較強，說明了利用串聯表達技術可以有效提高防御素的蛋白活性，使得雞防御素在預防和治療細菌感染具有潛在的應用價值，值得進一步探討。

本試驗成功構建可串聯表達Gal-5且具有生物學活性的大腸桿菌原核表達載體。