酯化型紅曲菌復合誘變選育及其固態發酵條件優化

趙志軍,趙 婷,3,劉延波,劉 寧,葛少華,潘春梅,孫西玉,5,*

(1.河南牧業經濟學院食品與生物工程學院(酒業學院),河南鄭州 450046; 2.河南牧業經濟學院河南省白酒風格工程技術研究中心,河南鄭州 450046; 3.湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068; 4.寶豐酒業有限公司,河南平頂山 467500; 5.河南張弓老酒酒業有限公司,河南商丘 476733)

中國白酒作為我國傳統的發酵食品,是最古老的蒸餾酒之一[1-2],在世界享有盛譽[3]。白酒中的微量成分眾多[4],這些微量成分在各種白酒中的含量和比例不同,導致了白酒香型和風格的多樣性。在白酒微量成分中,酯類含量最多且對白酒影響最大,是組成白酒香味的主要物質[1,5]。

紅曲菌(Monascussp.)又叫紅曲霉[6],是我國傳統的藥食兩用微生物資源[7]。紅曲菌的用途十分廣泛,在釀酒[8-9]、食品加工[10]、色素合成[11]及藥物制備[12]等領域均有重要應用價值。紅曲菌在生長代謝過程中能產生酯化酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶類,其酯化酶可以催化己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒中香味物質的形成[13-15]。從中國白酒釀造大曲中分離出酯化型紅曲霉,并進一步提升其產酯化酶能力,對白酒品質提高非常有意義。

目前,菌種改良的遺傳策略有隨機誘變、雜交育種和基因工程技術等手段[16-17],其中隨機誘變育種具有簡單、快速、有效等優點,被廣泛應用于發酵工業菌種的選育[18]。物理誘變因操作簡單、易于環保及對人體傷害小等優點得到廣泛應用[19]。常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)誘變育種技術是利用等離子體射流中富含的化學活性粒子直接作用于細胞遺傳物質,從而引發多類形式的DNA損傷,產生突變菌株[20]。同時該方法具有無污染和操作安全簡單的優點,在微生物育種和生物醫學等領域應用廣泛[21]。紫外(Ultraviolet,UV)誘變利用紫外線輻射微生物DNA分子,形成嘧啶二聚體影響堿基的正常配對,從而引起突變[22]。該方法因其設備簡單、易于操作,是最為常用的菌種誘變手段。一般認為復合誘變具有協同作用,其效果會比單一誘變效果更好[23]。

本研究以前期從釀酒大曲中分離獲得的紅曲菌為出發菌株進行UV-ARTP復合誘變,篩選高產酯化酶的突變菌株,采用單因素實驗確定各因素對菌株產酯化酶能力的影響,選取顯著性較強的因素進行響應面優化,以期得到高酯化力的紅曲菌并探索其最佳培養條件,為白酒品質的提高提供優良菌株來源及應用基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三株紅曲菌(N1,N2,N3) 河南牧業經濟學院河南省白酒風格工程技術中心從大曲中分離并保藏;馬鈴薯,麩皮、稻殼 市售;氯化鈉、乙醇、己酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;三丁酸甘油酯(分析純)、己酸乙酯(色譜純)、乙酸正戊酯(色譜純) 上海麥克林生化科技有限公司;斜面固體培養基:將200 g馬鈴薯(去皮)切成小塊,加入1000 mL蒸餾水,煮沸30 min,紗布過濾,然后加入20 g葡萄糖及20 g瓊脂,加熱攪拌溶解,補足水分至1000 mL,自然pH,121 ℃滅菌20 min;篩選培養基[24]:馬鈴薯(去皮)20%,蔗糖2%,三丁酸甘油酯0.4%,瓊脂2%,自然pH,121 ℃滅菌20 min;固態基礎發酵培養基:25 g的麩皮調整含水率為65%裝入250 mL三角瓶,121 ℃滅菌30 min。

磁力攪拌器 江蘇環宇科學儀器廠;LDZX-50KBS立式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;GH-500隔水式培養箱 北京科偉永興儀器有限公司;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海龍躍儀器設備有限公司;ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變育種儀 洛陽華清天木生物科技有限公司;Agilent 7890A氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 初始菌株酯化酶活力測定 將三株初始菌株分別接種至斜面固體培養基中,28 ℃活化制成孢子懸浮液。按4%的比例將孢子懸浮液分別接種于固態基礎發酵培養基,放置于28 ℃恒溫培養箱中,每24 h搖瓶一次,培養6 d。成熟后,將固態基礎培養基倒于已滅菌的牛皮紙上于鼓風干燥箱中35 ℃快速烘干,密封袋保存。

采用氣相色譜法測定紅曲菌麩曲酯化力[25]的方法。酯化力(以己酸乙酯計)定義為:1 g干曲粉在30 ℃反應100 h所產生的己酸乙酯毫克數,單位為mg/(g·100 h),以U/g表示。

1.2.2 誘變方法

1.2.2.1 孢子懸液的制備 選取酯化酶活力較高的菌株作為初始菌株,接種于試管斜面上,28 ℃活化培養7 d。向菌種斜面中加入適量無菌生理鹽水,用無菌接種環輕輕刮洗孢子,倒入已滅菌并裝有玻璃珠的三角瓶中,用玻璃珠將孢子充分打散。用血球計數板測定,用無菌生理鹽水稀釋孢子濃度至106個/mL,制得誘變用孢子懸液。

1.2.2.2 UV-ARTP復合誘變 將30 W紫外燈預熱20 min,將裝有孢子懸液的培養皿放到磁力攪拌器上,調節其與燈管垂直距離為30 cm,打開皿蓋紫外照射,分別選擇照射處理時間為0、30、60、90、120、150 s。結束后,避光穩定10 min,用移液槍取出被照射的孢子懸液0.1 mL,梯度稀釋后,涂布至篩選培養基上,將平板倒置于28 ℃恒溫箱中培養6 d,計數并測定單個菌落的透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)[26]。

將紫外誘變后D/d值大的菌株制成孢子懸液,取10 μL均勻涂抹在金屬菌物載片表面,用鑷子將菌物載片轉移到載物臺,設定參數在工作氣流量為10 L/min,等離子體發射源與樣品距離為2 mm,操作溫度由26 ℃逐步上升并穩定至35 ℃的條件下,分別處理20、35、50、65、80、95 s,處理后將載片轉移到裝有1 mL生理鹽水的EP管中,振蕩洗脫形成新的菌懸液。將誘變后和未誘變的菌懸液分別取0.1 mL稀釋適當梯度涂布于篩選培養基上,培養6 d后觀察菌落形態特征。采用平板活菌計數法來計算誘變致死率[27]。

1.2.3 篩選方法

1.2.3.1 突變菌株的初篩 將誘變后菌株接種至篩選培養基,平板倒置于28 ℃恒溫培養箱中培養6 d。觀察菌落周圍出現的透明圈大小和菌落顏色的變化,并測量D/d值,選擇其比值大且菌落直徑也比較大及顏色深的菌落進行菌株純化,劃線至斜面培養基,備用。

1.2.3.2 突變菌株的復篩 突變菌株酯化酶活力的測定,見1.2.1。

1.2.4 遺傳穩定性實驗 將UV-ARTP復合誘變處理后篩選得到的高產酯化酶紅曲菌突變菌株轉接至斜面固體培養基中,在28 ℃恒溫條件下培養6 d,連續傳代5次,分別在固態基礎培養基中培養并測定其酯化酶活力,驗證此突變菌株產酶活力的穩定性。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 接種量對菌株酯化力的影響 固態基礎發酵培養基中分別接入2%、3%、4%、5%、6%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下培養6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.2 含水量對菌株酯化力的影響 分別為60%、65%、70%、75%、80%含水量的固態基礎發酵培養基,接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下培養6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.3 溫度對菌株酯化力的影響 固態基礎發酵培養基中接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,分別在24、26、28、30、32 ℃條件下培養6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.4 培養時間對菌株酯化力的影響 固態基礎發酵培養基中接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下分別培養4、5、6、7、8 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.5.5 稻殼添加量對菌株酯化力的影響 分別添加0、4%、8%、12%、16%的稻殼至固態基礎發酵培養基,接入4%的孢子懸液于250 mL三角瓶,在28 ℃條件下培養6 d,每批做3個平行,測定酯化力。

1.2.6 響應面優化固態發酵條件 在單因素實驗的基礎上選取接種量(A)、含水量(B)、培養時間(C)3對紅曲菌發酵產酯化酶影響顯著的為自變量,以酯化酶活力為響應值(Y)利用Design-Expert 8.0.6軟件,根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理,設計三因素三水平響應面試驗,試驗因素與水平見表1,確定最優的固態發酵條件并進行試驗驗證[28]。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Box-Behnken test factors and levels

1.3 數據處理

利用Design-Expert 8.0.6和Excel 2016軟件對數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 初始菌株酯化酶活力測定

對三株初始紅曲菌酯化酶活力的測定,結果見表2。

表2 三株初始紅曲菌酯化酶活力Table 2 3 strains of initial Monascus esterification

由表2可知,N3紅曲菌的酶活力相對較高,為19.76 U/g。以該菌株作為出發菌株,進行復合誘變選育高產酯化酶的紅曲菌菌株。

2.2 UV-ARTP復合誘變

2.2.1 UV-ARTP分別誘變紅曲菌 UV-ARTP分別誘變紅曲菌致死率與時間的關系見圖1。

圖1 UV-ARTP分別誘變菌株致死率與時間的關系Fig.1 Relationship between lethality and time of UV-ARTP mutagenic strains注:a為UV誘變，b為ARTP誘變。

由圖1可以看出,隨著誘變時間的延長,菌株致死率在上升。當UV誘變時間為90 s時致死率為87.35%;當ARTP誘變時間為50 s時致死率為81.42%。一般認為致死率在80%～90%效果好且有利于正突變型菌株的產生,因此選擇UV處理90 s及ARTP處理50 s為最佳誘變時間。

2.2.2 UV-ARTP復合誘變紅曲菌 采用最佳誘變時間對紅曲菌進行復合誘變,以菌株N3作為出發菌株,經過UV處理90 s后涂布于篩選培養基上,暗條件下28 ℃培養6 d,從中挑選出一株D/d值最大的突變菌株Y4再經ARTP處理50 s,稀釋涂布于篩選培養基上,28 ℃培養6 d。對45株突變株測定其D/d值以及酯化酶活力,部分菌株測定結果見表3。

表3 UV-ARTP復合誘變結果Table 3 UV-ARTP complex mutagenesis results

由表3可知,UV-ARTP復合誘變對提高紅曲菌產酯化酶活力效果較顯著。其中突變菌株Z14酯化酶活力最高，為44.90 U/g。

2.3 突變菌株的遺傳穩定性實驗

對Z14進行連續傳代,測定其酯化酶活力,見圖2。

圖2 突變菌株Z14的遺傳穩定性Fig.2 Genetic stability of mutant strain Z14

由圖2可知,Z14經過連續傳代5次中,產酯化酶活力呈現先降低后趨于穩定的趨勢,穩定后Z14酯化酶活力為34.44 U/g,較出發菌株提高了74%。此時，Z14遺傳性能比較穩定,可選擇該菌株作為繼續研究的菌株。

2.4 單因素實驗結果

2.4.1 接種量對菌株酯化力的影響 接種量對紅曲菌發酵產酯化酶活力的影響見圖3。隨著接種量的增加,菌株產酯化酶活力呈現出先升高后降低的趨勢。當接種量為5%時酯化酶活力最高,為33.98 U/g。接種量過大,營養、溶解氧等不能滿足菌體的生長需要,產酯化酶活力下降。因此接種量5%為菌株培養基最適的接種量。響應面試驗接種量選取的水平為:4%、5%、6%。

圖3 不同接種量對菌株酯化力的影響Fig.3 Effect of different inoculation rates on the esterification power of the strain

2.4.2 含水量對菌株酯化力的影響 培養基含水量對紅曲菌發酵產酯化酶活力的影響見圖4。隨著固態基礎培養基中水分的增加,菌株產酯化酶活力呈現出先升高后降低的趨勢。當含水量為70%時產酯化酶活力最高,為34.66 U/g。培養基水分含量過低,不利于菌株生長和發酵產酶;過高則導致培養基結塊,不能充分散熱和通氧,也不利于酶活力的積累。因此含水量70%為菌株培養基最適的含水量。響應面試驗含水量選取的水平為:65%、70%、75%。

圖4 不同含水量對菌株酯化力的影響Fig.4 Effect of different water contents on the esterification power of the strains

2.4.3 溫度對菌株酯化力的影響 培養溫度對紅曲菌發酵產酯化酶活力的影響見圖5。隨著培養溫度的升高,菌株產酯化酶活力呈現先升高增加后降低的趨勢。當培養溫度為28 ℃時產酯化酶活力最高,為36.01 U/g。培養溫度過高,菌株生長受到抑制,同時也會使酶較快失活,不利于產酶及酶活力的積累。因此28 ℃為菌株最適的培養溫度。

圖5 不同溫度對菌株酯化力的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the esterification power of the strain

2.4.4 培養時間對菌株酯化力的影響 培養時間對紅曲菌發酵產酯化酶活性的影響見圖6。隨著培養時間的增加,菌株產酯化酶活力呈現出先升高后降低的趨勢。培養時間為7 d時產酯化酶活力最高,達到33.44 U/g。隨著培養時間延長,后期會產生一些有害代謝產物,不利于菌種的生長和代謝。因此7 d為菌株最適的培養時間。響應面試驗培養時間選取的水平為:6、7、8 d。

表5 響應面回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface regression equation

2.4.5 稻殼添加量對菌株酯化力的影響 稻殼添加量對紅曲菌發酵產酯化酶活性的影響見圖7。隨著稻殼添加量的增加,菌株產酯化酶活力呈現先升高后降低的趨勢。當稻殼添加量為4%時產酯化酶活力最高,為31.76 U/g。稻殼添加量過多,培養基疏松度越大,碳源、氮源含量降低,不利于菌體的生長及發酵產酶。因此稻殼添加量4%為菌株最適的稻殼添加量。

圖7 不同稻殼添加量對菌株酯化力的影響Fig.7 Effect of different rice husk additions on the esterification power of the strains

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 Box-Behnken試驗結果 響應面試驗結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計與結果Table 4 Box-Behnken test design and results

圖8 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the interaction of various factors

2.5.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表4的實驗結果進行多元二次回歸擬合,回歸方程的方差分析結果見表5。

由表5可知,回歸模型F值為34.64,且顯著性檢驗為極顯著(P<0.0001),失擬項不顯著(P=0.3611>0.05),可知該模型可靠。

2.5.3 各因素交互作用的響應面圖 利用Design-Expert 8.0.6軟件對二次響應面回歸模型做出相應的響應曲面。由回歸模型繪制的響應面圖,見圖8所示。

響應曲面圖可以直觀的反映出兩因素交互作用對響應值的影響。由圖8可知,接種量和含水量、接種量和培養時間、含水量和培養時間三種交互組合的響應面等高線排列稀疏,說明此三種交互作用對響應值的影響不顯著。

2.5.4 最佳發酵條件的確定及驗證 從上述回歸模型中求得最佳固態發酵條件為:接種量為5.09%、含水量為70.31%、培養時間為7.31 d。此條件下,模型預測值酯化酶活力為37.70 U/g。考慮到實際情況,調整條件為:接種量為5%、含水量為70%、培養時間為7 d進行驗證試驗。結果表明,在最佳發酵條件下酶活力達38.53 U/g,與預測值基本接近,說明所建模型擬合良好且可靠。經單因素和響應面法優化發酵條件后,菌株產酯化酶水平明顯提高,較出發菌株提高了95%。

3 討論與結論

本試驗采用UV-ARTP復合誘變手段對紅曲菌進行誘變育種,通過酯化酶透明圈法初篩和氣相色譜法測酯化酶活力復篩,選育出1株產酯化酶活力提高較大的紅曲菌Z14,經連續傳代其酯化酶活力穩定至34.44 U/g,較出發菌株提高了74%。通過單因素試驗及響應面優化得到其最佳固態發酵條件為:接種量為5%、含水量為70%、培養時間為7 d。在此條件下其產酯化酶活力達到38.53 U/g,較出發菌株提高了95%。

研究表明,ARTP誘變技術能夠高效快速使微生物發生突變。蔣汶等[29]采用UV-ARTP復合誘變方法對紅曲霉ZL307進行誘變,多糖產量與原始菌株相比提高了61.18%。方春玉等[30]對紅曲霉菌株的原生質體進行紫外線和超聲波的復合誘變,經固態發酵后酯化力與出發菌株相比提高了83.2%。本實驗以紅曲菌N3為出發菌株進行UV-ARTP復合誘變,并優化了其固態發酵條件與出發菌株相比酯化酶活力有較大提高。

關于紅曲菌誘變育種的研究較多,但對高酯化力紅曲菌進行復合誘變并優化其固態發酵產酯化酶條件的研究尚未見報道。本研究采用復合誘變手段獲得高酯化力紅曲菌突變株并利用響應面法對其產酯化酶條件進行了優化。為酯化型紅曲菌用于濃香型白酒的生產,提升白酒質量和提高優級酒產率,奠定理論研究基礎和優質菌種來源。