諾鄧火腿加工過程中細菌群落的動態變化

王馨蕊,史 巧,*,劉畢琴,雷永德,湯回花,張紹智,張軍軍,李 宏,*

(1.云南省農業科學院農產品加工研究所,云南昆明 650000; 2.云南瑞通牧業科技開發有限公司,云南大理 671000)

諾鄧火腿出產于云南滇西的千年白族古村諾鄧村。火腿以當地散養豬為原料,用獨特的井鹽腌制[1],經過復雜的加工后,在當地溫和的氣候下經過至少10個月的發酵,形成了富有特色的諾鄧火腿,其與宣威火腿、鶴慶圓腿并稱為云南三大著名火腿。

在火腿成熟過程中微生物對風味的形成起著一定的關鍵作用[2],自然發酵火腿中微生物的群落組成和消長受氣候及地域的影響,這也決定了火腿的特色。國內開展了金華火腿、云南火腿等微生物區系的研究[3-5],大部分是基于純培養的方法,再利用微生物的形態學、生理生化特性或者測序進行鑒定,工作量相對較大,也容易遺漏一些不可培養的微生物,不能完整的反映火腿中微生物組成情況。下一代測序技術(next generation sequencing)作為一種高效的方法,在傳統發酵食品微生物研究中已經有廣泛運用[6]。運用高通量測序技術,能夠更全面、真實的掌握發酵過程中微生物的種群結構和變化。

火腿中細菌多樣性的研究,現多集中于不同年限成品火腿及其表面的微生物。黨喜軍[7]研究了不同年份的成品諾鄧火腿,發現發酵3年的火腿較1、2和4年的樣品表面細菌多樣性更高,葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬、Solitalea和志賀氏菌屬為優勢細菌。郭明亮[8]對發酵4個月、2年的金華火腿和成品宣威火腿的細菌菌群進行分析,發現檸檬酸菌屬、嗜冷桿菌屬、庫爾特氏桿菌屬、葡萄球菌屬、耶爾森氏菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬和芽孢桿菌屬為主要菌群。母雨等[9]對來自3個不同地區的盤縣火腿開展研究,發現成品盤縣火腿中的優勢細菌來自葡萄球菌屬和鹽單胞菌屬。對于諾鄧火腿各加工階段內部細菌群落動態變化還未有報道。本研究通過MiSeq平臺對諾鄧火腿內部細菌測序,并測定火腿部分理化指標,分析比較諾鄧火腿加工過程中不同階段的細菌組成和變化,結合與各理化指標的關聯性分析,以期為開發針對諾鄧火腿特點的發酵劑提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾鄧火腿 原料來自當地傳統工藝加工廠家;酚酞(C2OH14O4)、氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、谷氨酸(C5H9NO4)、茚三酮(C9H6O4)、鉻酸鉀(K2CrO4)、硝酸(HNO3)、硝酸銀(AgNO3)、鹽酸(HCl)、基準氯化鈉(NaCl)、無水乙醇(CH3CH2OH) 均為國產分析純試劑。

DHG-9140A鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;GYW-1W水分活度測定儀 深圳冠亞水分儀科技有限公司;AUY220電子天平 島津制作所;XW-80A渦旋振蕩器 上海精科實業有限公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司;3H16RI高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MULTISKAN GO酶標儀 Thermo Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 選擇十二支重量接近的洋三元豬后腿隨機編號,并作統一處理和后續管理,在4個不同的加工時期以相同的方式在半膜肌部位取樣,每個時間點取3支,取樣階段分別為腌制期(上3次鹽后)、風干期(上掛48 d)、發酵期(上掛104 d)、成熟期(上掛278 d),相應的編號為S1、S2、S3、S4。用于理化性質測定的樣品為半膜肌內部中心瘦肉;用于高通量測序的樣品需灼燒半膜肌表面,在無菌操作下切取內部約1 g瘦肉,置于無菌凍存管中,-80 ℃保存備用。

1.2.2 理化性質測定 水分含量的測定參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法。氯化物含量的測定參照GB 5009.44-2016《食品中氯化物的測定》中的直接滴定法。酸堿度的測定參照GB 5009.237-2016《食品pH的測定》。游離氨基酸含量的測定,以劉慧燕等[10]方法作為參考,略作調整后方法如下:反應體系為1 mL樣品溶液+0.5 mL pH8.0的磷酸鹽緩沖液+0.5 mL 2%茚三酮的溶液,反應液水浴加熱15 min,冷卻10 min后蒸餾水定容至25 mL,靜置10 min,在570 nm處測定吸光度,以谷氨酸標準溶液繪制標準曲線,標準曲線方程為y=1.4933x-0.0801,R2=0.9968。以上理化指標均設三個重復,利用Excel 2010軟件對測定結果進行統計分析,數據結果采用平均值±標準誤差表示。

1.2.3 DNA抽提和PCR擴增 根據FastDNA? SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals,Solon,OH,U.S.)說明書進行微生物群落總DNA抽提,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量,使用NanoDrop2000測定DNA 濃度和純度;使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增,擴增程序如下:95 ℃預變性3 min,27個循環(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),然后72 ℃穩定延伸10 min,最后在4 ℃進行保存(PCR儀:ABI GeneAmp? 9700型)。PCR反應體系為:5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng,補足ddH2O至20 μL。每個樣本3個重復。

表1 諾鄧火腿理化性質Table 1 Physicochemical properties of Nuodeng dry-cured ham

1.2.4 Illumina MiSeq測序 將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進行回收產物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer(Promega,USA)對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit進行建庫:a.接頭鏈接;b.使用磁珠篩選去除接頭自連片段;c.利用PCR擴增進行文庫模板的富集;d.磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序 上海美吉生物醫藥科技有限公司。

1.3 數據處理

使用fastp[11](https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0)軟件對原始測序序列進行質控,使用FLASH[12](http://www.cbcb.umd.edu/software/flash,version 1.2.7)軟件進行拼接:

a.過濾reads尾部質量值20以下的堿基,設置50 bp的窗口,如果窗口內的平均質量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,過濾質控后50 bp以下的reads,去除含N堿基的reads。

b.根據PE reads之間的重疊區域(overlap)關系,將成對reads拼接(merge)成一條序列,最小overlap長度為10 bp。

c.拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2,篩選不符合序列。

d.根據序列首尾兩端的核苷酸標簽(barcode)和引物區分樣品,并調整序列方向,barcode允許的錯配數為0,最大引物錯配數為2。

使用UPARSE[13]軟件(http://drive5.com/uparse/,version 7.1),根據97%[13-14]的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[15](http://rdp.cme.msu.edu/,version 2.2)對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva 16S rRNA數據庫(v138),設置比對閾值為70%。

2 結果與分析

2.1 諾鄧火腿加工過程中理化性質的變化

諾鄧火腿在四個時期主要理化指標結果見表1。含水量隨著發酵的進行,總體呈下降趨勢。風干期(S2)空氣比較干燥,含水量下降較快。5月雨水較多,空氣濕度大,發酵期(S3)的火腿含水量有小幅增加[16]。經過9個多月的發酵后,火腿中的含水量最終降到33.40%左右。已有的研究發現諾鄧火腿成品腿的含水量在30.66%～35.22%左右[7,17]?？婃玫萚18]研究發現經過9個月發酵的云腿,含水量為43.45%。李澤眾等[19]對三川火腿的研究顯示,第320 d時火腿中的水分含量為44.27%?？傮w上看,諾鄧火腿半膜肌部位相較于云南其他地域的火腿,含水量偏低。

腌制期鹽含量較低,鹽含量約為4.95%。隨著火腿不斷失水,鹽含量相應地升高,在風干期達到7.21%。雨季來臨后,含水量的增加稍微降低了火腿中鹽含量,成熟期的火腿鹽含量在6.7%。食鹽含量在1%～3%時可以抑制一些微生物的生長,當達到10%～15%的含鹽量時,只有少部分耐鹽微生物能夠生長。高鹽含量的火腿雖然不易變質,但是由于內源酶和微生物受到抑制也不會產生火腿特有的香味[20]。并且攝入過多的氯化鈉會對人的心血管健康造成影響[21]?？婃玫妊芯康脑仆塞}分含量為9.62%[18],發酵12個月的宣威火腿鹽含量為10.97%[22],15個月的大河烏豬火腿食鹽含量為10.05%[23],諾鄧火腿較其他品類的火腿含鹽量比較適中。

火腿的酸堿度在各個時期各有不同。腌制期pH較低,風干期由于蛋白質水解產生的堿性物質[4,24],pH增加至6.10。發酵期可能由于溫度較高,產酸細菌大量繁殖和代謝,酸堿度有一定幅度的降低,適當的酸化可以產生一些風味上的變化[25]。隨著火腿的不斷發酵成熟,pH呈現上升的趨勢,成熟期達到6.05左右,與黨喜軍測定的1年諾鄧火腿pH基本一致[7]。其他品類的火腿pH基本在5.58～6.75之間[18,22,26-27]。

諾鄧火腿中的游離氨基酸含量,隨著時間的推移不斷增加,成熟期增加速度較快,9個多月后達到了1862.33 mg/100 g。蛋白質水解可產生大量小肽和游離氨基酸,火腿中的非蛋白氮70%～80%為多肽氮和氨基酸態氮[28]。游離氨基酸本身是火腿中重要的滋味物質和營養成分,一些特定的氨基酸形成揮發性香氣的前體物質,氨基酸與其他化合物參與美拉德反應可以產生小分子香氣成分[29]。根據現有報道,一年左右的火腿游離氨基酸含量在1.97%～3.67%[7,19],與本實驗當年腌制的不足一年火腿蛋白質降解趨勢吻合。

2.2 測序結果及Alpha多樣性

分別對4個不同加工階段,共12個諾鄧火腿樣本內部的細菌16S rRNA V3-V4區域進行擴增,獲得有效序列數目為587967 reads,有效堿基251376192 bp,序列平均長度約為428 bp。由于不同樣本具有個體差異性,為使各樣本在相同OTU序列數水平上進行對比,保留至少在3個樣本中的序列數都大于等于5的OTU,按最小樣本序列數將所有樣本的序列隨機抽取至統一數據量,

表2 Alpha多樣性指數表Table 2 Alpha diversity index

抽平后各樣本有效序列數為31426,有效序列總數為377112。4個時期的12個樣本細菌分類統計數目為7門,11綱,25目,47科,83屬,130個OTU。

通過統計隨機抽取的序列對應樣本的Alpha多樣性指數,繪制出稀釋曲線,若曲線較為平緩,則本次測序數據量是足夠的[30]。圖1為基于豐富度實際觀測值sobs指數的稀釋曲線,曲線已達到平臺期說明測序量充足,大部分多樣性已經產生,繼續增加測序量也很少有新物種出現。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves

各個階段內火腿中微生物群落的多樣性可以通過Alpha多樣性來反映,常用sobs指數、Chao1指數、heip均一度指數、香農指數、辛普森指數等來計算和比較[31]。不同時期諾鄧火腿中細菌群落的Alpha多樣性在表2中表示,其中sobs指數、Chao1指數用來反映群落的豐富度,heip均一度指數用來反映群落的均一性,群落多樣性則通過香農指數、辛普森指數、覆蓋率等來表示。S1的細菌豐富度最高,S4次之,S2和S3較低。S1的細菌群落分布最均勻。通過香農指數、辛普森指數發現S1的多樣性最高,S4多樣性較高,S2、S3多樣性明顯低于S1、S4。

2.3 物種組成

對于火腿加工過程中內部的細菌,已有研究者通過傳統培養的方式發現其總體變化趨勢。大體上從腌制期至風干期菌落總數持續上升,從約102CFU/g增加至106CFU/g,在發酵期初期達到峰值,之后不斷減少,到成熟期只有約10CFU/g的細菌被培養出來[4,5,32-33],但對于考察火腿成品食用安全性有重要意義。在前人對細菌數量變化研究的基礎上,通過高通量測序方法更為全面的檢測,有助于進一步了解加工過程中諾鄧火腿內部細菌多樣性及其演變規律。

2.3.1 物種組成Venn圖分析 由OTU水平上的Venn圖(圖2)可以看出,4個不同時期的火腿微生物有61個共有OTU,其中相對豐度最高的5個屬為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和希瓦氏菌屬(Shewanella),這些微生物屬于厚壁菌門及變形菌門,其他還包括氣單胞菌屬(Aeromonas)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和弧菌屬(Vibrio)等38個屬的細菌,為諾鄧火腿整個發酵過程中均有出現的微生物。每個時期的特異性OTU數目較少,S1有1個,為Weeksellaceae科細菌;S4有4個,分別為沙雷氏菌屬(Serratia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)和Enteractinococcus屬細菌。由于發酵進行至S2、S3時期時細菌群落多樣性較低,S1與S2、S2與S3、S3與S4時期之間共有,且其余時期不具有的OTU數目均較少,分別為1、2、1;而S1、S4由于多樣性較高,兩者之間的共有OTU有24個。

圖2 OTU水平物種組成Venn圖Fig.2 Venn diagram on OTU level 注:S1、S2、S3、S4分別為腌制期、風干期、 發酵期、成熟期;數字代表OTU數目。

2.3.2 門水平的群落組成 S1、S2、S3、S4四個時期在門水平上的群落組成如圖(圖3)。4個時期的主要優勢菌有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。占比最高的2個門在4個時期的相對豐度依次為厚壁菌門:S2>S3>S4>S1,變形菌門:S1>S4>S3>S2。腌制期(S1)主要由變形菌門微生物組成,相對豐度約92%;風干期(S2)和發酵期(S3)主要由厚壁菌門及變形菌門組成,兩個時期的厚壁菌門相對豐度分別為94%、92%,變形菌門相對豐度分別為6%、8%,隨著發酵的進行,厚壁菌門微生物占比逐漸減少,而變形菌門微生物相對增多;成熟期(S4)微生物組成相對復雜,有厚壁菌門(37%)、變形菌門(61%)及放線菌門(3%),相對于發酵期,成熟期的變形菌門微生物增加,厚壁菌門微生物明顯減少。

圖3 門水平的群落組成條形圖Fig.3 Community bar plot analysis on phylum level

圖4 屬水平的群落組成熱圖Fig.4 Community heatmap on genus level

2.3.3 屬水平的群落組成 選取4個時期豐度在前50的屬,繪制群落組成heatmap(圖4)。各時期火腿中細菌在屬水平上的組成形式存在明顯差異,根據各屬在4個時期豐度的相似性進行聚類,可以聚為5個大類。第Ⅰ類由葡萄球菌屬(Staphylococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)和羅爾斯通菌屬(Ralstonia)3個屬組成,這3個屬在S4階段相對豐度很高,其中葡萄球菌屬在火腿加工的各個階段較其他2個屬細菌有較高豐度,與已有研究結果一致,葡萄球菌屬細菌為火腿中最常被檢測到高豐度的細菌[2,8-9]。葡萄球菌屬是火腿發酵中重要的細菌,這類細菌含有硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶,能夠促進肉質形成理想的紅色,并且在蛋白水解酶和脂肪酶作用下能夠增加產品風味,防止脂質氧化和酸敗[34-35]。成熟的盤縣火腿中也檢測到少量豐度的Ralstonia[9],這類細菌可能參與構成火腿成熟期獨特細菌群落。第Ⅱ類在各個時期均有較高豐度,在S1時期分布最集中,由嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)組成。傳統分離培養的方法一般認為在腌制期的火腿優勢細菌為葡萄球菌、乳酸菌和假單胞菌,高通量測序的方法發現了在腌制期火腿內部其他高豐度細菌種類。這類細菌在發酵肉制品中較為常見,董蘊等[36]發現恩施臘肉中嗜冷桿菌屬、不動桿菌屬等細菌也很豐富。第Ⅲ類為相對豐度中等,且分布較均勻的屬。第Ⅳ類為相對豐度稍低的一類,在S1、S4分布較S2、S3稍高,種類比較豐富。第Ⅴ類為S4時期豐度稍高,但在其他階段豐度較低的細菌,包括Cutibacterium、考克氏菌屬(Kocuria)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)等屬的細菌。

2.4 不同階段樣本比較

在OTU水平上,根據Bray-Curtis距離算法得到Beta多樣性距離矩陣,利用非加權組平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean,UPGMA)對4個時期的不同樣本進行層級聚類(Hierarchical clustering),可以清楚地看出樣本間群落結構的相似或差異程度(圖5)。S4時期的兩個樣本聚為一類,成熟期的火腿微生物群落不同于其他3個時期,但組內平行樣本仍存在個體差異性,近期另一諾鄧火腿研究也發現成熟腿平行樣本之間存在一定細菌組成差異性[7]。S1時期樣本單獨聚成一類,可見腌制期火腿組內樣本的細菌群落組成相似性很高,并且與其他3個時期相比較為獨特。S2與S3兩個時期的細菌群落相似性較高。外部環境及火腿內部理化條件的不同可能是差異發生的原因,腌制期火腿內部含水量高,適合多種微生物的生長,細菌群落較其他3個時期豐富;風干期含水量逐步降低,鹽濃度增加,只適合一部分細菌生存;發酵期火腿內部環境與風干期類似,但由于空氣濕度的變化,火腿內部細菌群落會產生部分差異;成熟期內部細菌數量已經較少[32],但環境溫度較高,內部細菌組成較前面的加工階段有所不同,而且由于內部復雜的理化環境影響,各個樣本之間也會產生不同的變化。

圖5 基于OTU水平的樣本層級聚類樹Fig.5 Hierarchical clustering tree based on OTU level

圖6 諾鄧火腿理化性質與細菌群落相關性分析Fig.6 Correlation analysis between physicochemical properties and bacterial community of Nuodeng dry-cured ham注:A:屬水平上的冗余分析;B:豐度前10的屬與理化性質關聯熱圖;W代表含水量、S代表鹽含量、 AA代表游離氨基酸含量、pH代表酸堿度;* 0.01

2.5 理化性質與樣本關聯性

冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)是環境因子約束化的PCA分析,可以將樣本和環境因子反映在同一個二維排序圖上,從圖6A中可以直觀地看出樣本分布和環境因子間的關系。圖6A中代表含水量(W)、鹽含量(S)的環境因子箭頭長度最長,表示水分和鹽含量對于不同時期樣本細菌群落組成的影響程度最大;游離氨基酸含量(AA)次之;樣品酸堿度(pH)影響較小。將各環境因子變量射線延長,4個加工時期各樣本垂直投影于射線上,投影點越靠近箭頭所指方向的樣本,受環境因子的影響越大。分析發現含水量對腌制期(S1)樣本影響最大;含鹽量對風干期(S2)和發酵期(S3)影響最明顯;樣品酸堿度和游離氨基酸含量與成熟期(S4)細菌群落結構關聯性最大。

通過計算4個環境因子與豐度最高的10個屬之間的spearman等級相關系數,獲得數值矩陣,繪制出heatmap。從圖6B中可以看出有4個屬與環境因子之間有顯著相關關系。葡萄球菌屬(Staphylococcus)與含鹽量顯著正相關,其在4個階段的相對豐度占比依次為S2(94%)>S3(86%)>S4(47%)>S1(1.7%),伴隨著火腿失水,鹽含量的增加一定程度上增加了葡萄球菌在火腿微生物群落中的數量。以葡萄球菌為代表的凝固酶陰性球菌(CNC,Coagulase-negative cocci)是火腿中經常被報道的優勢菌,在帕爾馬、伊比利亞火腿中也較為常見。在腌制前期,帕爾馬火腿內部以革蘭氏陰性菌(55%)占據主導,25 d后CNC成為優勢菌,并且一直保持至211 d,一年后豐度有所下降但仍為主要的細菌組成部分[27]。諾鄧火腿內部細菌群落的演替與其規律相符,提示在干腌火腿加工過程中CNC作為普遍存在的原生菌發揮了特定作用,現已被廣泛用于肉制品發酵[37]。氣單胞菌屬(Aeromonas)與含水量顯著正相關,這個屬的相對豐度占比在4個時期中S1最高,腌制期較多的水分可能有利于該屬的分布。嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)2個屬與游離氨基酸含量極顯著負相關,游離氨基酸含量在S4階段達到較高水平,該階段這2個屬的細菌占比相較于其他階段低。

3 結論與討論

本研究通過高通量測序方法對諾鄧火腿4個不同加工階段的細菌群落進行了分析,更為高效、全面的反映了其動態變化,發現腌制期的細菌多樣性最高,成熟期多樣性較高,風干期和發酵期多樣性相對較低,同時腌制期細菌的豐富度和均一性也是最高的?；鹜劝l酵過程中厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等細菌為優勢菌群。4個加工階段共有的61個OTU主要由葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬及希瓦氏菌屬等43個屬的細菌組成,為諾鄧火腿發酵發酵過程中均有出現的菌群。腌制期細菌物種比較豐富,與其他3個時期差異較大,風干和發酵期物種組成最相似。整個加工過程中豐度占比最高的為葡萄球菌屬,其在腌制初期不占優勢,從風干期開始成為優勢菌群,隨著發酵的進行又逐漸緩慢減少。對諾鄧火腿理化指標的分析發現火腿中的含水量總體為下降趨勢,最終達到約33.4%,較其他種類火腿偏低;通過關聯性分析發現含水量對腌制期細菌群落影響最大。隨著火腿不斷失水,含鹽量呈上升趨勢,成熟期的諾鄧火腿含鹽量約為6.7%,與云南其他火腿相比含鹽量較為適中;含鹽量對風干期和發酵期菌群組成影響最明顯,在這兩個時期豐度占比最高的葡萄球菌屬與含鹽量顯著正相關。成熟期的菌群結構與火腿酸堿度及游離氨基酸含量關聯度最大,這個時期的酸堿度為6.05左右,與其他火腿基本一致,游離氨基酸含量在這一階段增長較快,發酵9個多月后達到1.86%。傳統火腿加工過程中主要通過觀察外部霉菌的生長情況來判斷產品質量,而細菌不能直接被觀察到。干腌火腿是我國重要的發酵肉制品,利用二代測序技術研究其內部細菌的報道相對較少,研究尚不充分,研究對象也大多為成品火腿,加工過程中細菌的組成和變化有必要加以探索。諾鄧火腿是云南重要的特色食品,其加工過程中內部的細菌動態變化是首次報道。為滿足現代多樣化飲食的需求,成品火腿被用于生食,成熟期細菌的組成為保證其食品安全提供了參考。

在諾鄧火腿的自然發酵過程中,腌漬和失水作用初期細菌種類豐富,主要有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等細菌,但大部分屬于食品加工中不希望出現的微生物。隨著發酵進行,發酵肉制品中的常見有益菌[38]葡萄球菌占比持續增加,而雜菌不斷減少。在腌制期加入適合的發酵劑,可以有效抑制雜菌的生長,降低衛生風險,保證產品品質標準化[39]。干腌肉制品的味道是火腿組織中的大分子在各種酶和非酶作用下分解后產生的,風味的形成一般分為兩個階段,第一階段是在腌制期、風干期和發酵前期發生的自然氧化,而第二階段是在發酵后期及成熟期發生的微生物次生代謝,特別是氨基酸的分解代謝[27]。CNC是肉制品發酵中主要的原生微生物群體[38],也是發酵肉制品工業上常用的發酵菌種。其能夠適應一定濃度氯化鈉、硝酸鹽存在的環境,在發酵過程中可迅速占據主導地位,通過參與蛋白水解和脂肪降解,影響產品最終的風味品質。諾鄧火腿自然發酵過程中出現的CNC為研究者今后在發酵劑的選擇上提供了重要依據,特別是篩選那些很好地適應了火腿發酵條件的菌株。在加工過程中,研究者們可以通過掌握的諾鄧火腿內部細菌總體變化信息,設計原生菌種發酵劑,形成優勢菌落,促進產品風味的標準化。已有研究者篩選出了如木糖葡萄球菌、馬胃葡萄球菌等有利于火腿品質形成菌種為發酵劑[39],產生的產品具有良好的色澤和風味。為了提高諾鄧火腿生產效率、保證產品質量,利用火腿中具有良好功能特性的原生菌種,研究其對產品安全性、風味品質的影響,開發特色菌種發酵劑是下一步研究的方向。