復合酶分步水解法制備漢麻多肽及其抗氧化特性研究

朱秀清,李美瑩,孫冰玉,王子玥,楊宏哲,孟 妍,張 娜,王 冰

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室, 黑龍江省谷物食品與綜合加工重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

漢麻(CannabissativaL)又名大麻、火麻等,是大麻科大麻屬的一年生草本植物,國際上將四氫大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻稱為工業大麻,我國則稱之為漢麻[1-3],漢麻籽籽仁可食用,是近幾年食品、藥品和保健品領域的研究熱點[4]。漢麻籽仁中蛋白質含量為20%～25%,脂類含量為25%～35%,碳水化合物含量為20%～30%,脂溶性維生素含量為10%～15%,并含有豐富的礦物質,是人體優質的營養來源[5-7]。漢麻分離蛋白(Hempseed protein isolate,HPI)不含如大豆中的胰蛋白酶抑制劑、低聚糖等抗營養因子,不會影響漢麻籽蛋白的消化吸收,且氨基酸組成均衡[8-9],是一種良好的植物蛋白資源,其開發利用具有廣闊的應用前景。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Ezymatic conditions of different proteases

近年來,生物活性肽的研究成為食品領域的焦點,與蛋白質相比,生物活性肽更易被人體消化吸收[10-11],并具有調節人體生理功能的功效[12],例如,提高抗氧化性、降血壓、降血脂、抑菌等作用[13-15]。制備生物活性肽的方法有蛋白質酶解法、化學合成法和微生物發酵法等,其中酶解法具有安全性好、操作簡單、條件易控制等優點而成為最常用的制備生物活性肽的方法。漢麻多肽是漢麻分離蛋白經水解制得的小分子肽,對保健食品系列的開發和人類健康的促進具有積極的推動作用。目前,國內對漢麻多肽的研究主要集中在單酶水解方面。梁凱[16]用堿性蛋白酶對漢麻籽分離蛋白進行酶解,在最佳工藝條件下的得到的水解度為21.87%。Tang等[17]用六種不同的蛋白酶分別對漢麻蛋白進行酶解,獲得的水解產物具有不同的肽得率和表面疏水性,表現出不同的抗氧化活性,并呈正相關的關系。但用復合酶分步水解的方式制備漢麻多肽的研究報道較少。

本研究以HPI為原料,通過對不同蛋白酶的篩選,選擇采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復合酶分步水解的方式對漢麻分離蛋白進行酶解,通過響應面優化制備漢麻多肽的最佳工藝條件,同時對漢麻多肽抗氧化能力進行評價,以期為高F值漢麻肽的制備提供理論基礎,為漢麻蛋白肽的功能性開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢麻分離蛋白(蛋白質含量92.48%,脂肪含量0.38%) 實驗室自制;堿性蛋白酶(138526 U/g)、中性蛋白酶(87162 U/g)、木瓜蛋白酶(16460 U/g)、風味蛋白酶(23541 U/g)、胰蛋白酶(78135 U/g) 諾維信生物技術有限公司;正己烷、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等 均為國產分析純;DPPH試劑 德國Ruibio公司。

PHS-25型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;HH-S4型恒溫溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;FA224電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;TG16-WS離心機 湘儀實驗室儀器開發有限公司;PCE-E3000恒溫振蕩器 蘇州凱特爾儀器有限公司;Alpha-1506型分光光度計 上海市譜光儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漢麻多肽的制備 在室溫下將5 g冷凍干燥的HPI分散在100 mL的去離子水中,攪拌均勻后在90 ℃水浴鍋中預處理10 min,降溫至酶解反應溫度時保溫5 min左右,用1.0 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調pH至酶的最適pH后加入蛋白酶,在酶解過程中保持混合物的pH恒定,反應結束后,在沸水浴中滅酶10 min來終止反應,酶解液冷卻后,在8000 r/min下離心10 min,除去不溶性殘余物,將上清液的pH調節至7.0后冷凍干燥,備用。

1.2.1.1 蛋白酶的篩選 取質量濃度為5%的HPI溶液,分別加入堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風味蛋白酶,加酶量為 10000 U/g,并在其各自的最適溫度、pH等(表1)條件下,對HPI進行水解,并測定各酶解液的水解度及漢麻蛋白肽含量。

1.2.1.2 酶解方式的確定 選取兩種酶解效果較好的酶制劑進行1∶1分步酶解,以水解度與漢麻蛋白肽含量為指標,研究加酶方式對酶解效果的影響。按表2的酶解條件分別考察三種加酶方式對酶解效果的影響。

表2 酶解方式對酶解效果的影響Table 2 Effect of enzymolysis mode on enzymolysis effect

1.2.1.3 堿性蛋白酶酶解的單因素實驗 在HPI為5%條件下,固定反應溫度55 ℃、反應時間2 h、加酶量10000 U/g,考察不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)對HPI水解度和肽含量的影響;固定反應時間2 h,反應pH8.5,加酶量10000 U/g,考察不同溫度(45、50、55、60、65 ℃)對HPI酶解效果的影響;固定固定反應溫度55 ℃、反應時間2 h、反應pH8.5,考察不同加酶量(6000、8000、10000、12000、14000 U/g)對HPI酶解效果的影響;固定反應溫度55 ℃、反應pH8.5、加酶量10000 U/g,考察不同時間(1、1.5、2、2.5、3 h)對HPI酶解效果的影響。

1.2.1.4 堿性蛋白酶酶解的響應面設計 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken試驗設計原理,選擇底物濃度為5%,時間2 h,以pH、溫度、加酶量三個因素為自變量,采用軟件Design-Expert V8.0.6設計三因素三水平的響應面分析試驗,因素與水平設計如表3所示。

表3 響應面試驗因素與水平Table 3 Factors and their levels used in response surface experiment

1.2.1.5 木瓜蛋白酶酶解的單因素實驗 在堿性蛋白酶酶解滅酶后,加入木瓜蛋白酶進行酶解。固定反應溫度50 ℃、反應時間2 h、加酶量5000 U/g,考察不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)對HPI水解度和肽含量的影響;固定反應時間2 h,反應pH6.5,加酶量5000 U/g,考察不同溫度(45、50、55、60、65 ℃)對HPI酶解效果的影響;固定反應溫度50 ℃、反應時間2 h、反應pH6.5,考察不同加酶量(2000、3000、4000、5000、6000 U/g)對HPI酶解效果的影響;固定反應溫度50 ℃、反應pH6.5、加酶量5000 U/g,考察不同時間(1、1.5、2、2.5、3 h)對HPI酶解效果的影響。

1.2.1.6 木瓜蛋白酶酶解的響應面設計 根據Box-Behnken試驗設計原理,選擇時間2 h,以pH、溫度、加酶量三個因素為自變量,采用軟件Design-Expert V8.0.6設計三因素三水平的響應面分析試驗,因素與水平設計如表4所示。

表4 響應面試驗因素與水平Table 4 Factors and their levels used in response surface experiment

1.2.2 水解度的測定 水解度是指蛋白質水解斷裂的肽鍵占蛋白質中總肽鍵的比例,能夠表示蛋白質的水解程度。本試驗采用甲醛滴定法[18]。吸取10 mL酶解液,加入蒸餾水60 mL后攪拌均勻,用0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至pH8.2時停止攪拌,記錄體積;加入中性甲醛10 mL,再用NaOH標準溶液滴定至pH9.2,記下加入甲醛后消耗的氫氧化鈉體積V。同時做空白實驗,記錄消耗的氫氧化鈉體積V0。并用以下公式計算水解度。

式中:DH為水解度,%;C為NaOH溶液濃度,mol/L;V為滴定消耗NaOH溶液體積,mL;V0為空白滴定消耗NaOH溶液體積,mL;0.014為氮毫克當量;M為樣品中總氮含量,g。

1.2.3 肽含量的測定 標準曲線繪制:精確稱取酪蛋白標準品12 g,用蒸餾水配制成濃度為12 mg/mL母液備用。采用梯度稀釋法將其依次配成10、8、6、4、2 mg/mL溶液。各取1 mL與3 mL雙縮脲試劑混合均勻,放置30 min,在λ=540 nm波長下測其OD值。以酪蛋白濃度(mg/mL)為橫坐標,OD值為縱坐標,制作標準曲線。

量取一定體積酶解液,加入一定體積三氯乙酸,混勻,離心,取上清液,再用漏斗過濾,靜置30 min;再將濾液與雙縮脲試劑混合,在540 nm波長下測定OD值。按標準曲線算出其含量,再乘以樣品稀釋比例,即為肽含量[19]。

1.2.4 抗氧化能力測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 參考Chen等[20]的方法,略作修改。取冷凍干燥樣品,配制成不同濃度,取2 mL樣品加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇混合溶液2 mL,混合搖勻后在避光處靜置30 min,然后在517 nm處測得吸光值Ai。以無水乙醇溶液代替DPPH溶液作為空白組Aj,以等體積蒸餾水代替樣品溶液作為對照組A0。以VC為陽性對照。

式中:Ai-樣品組吸光度;Aj-空白組吸光度;A0-對照組吸光度。

1.2.4.2 鐵還原力的測定 參考Remanan等[21]研究方法并略作修改。取2.0 mL不同濃度的樣品溶液,與2 mLPBS溶液(0.2 mol/L)和2 mL鐵氰化鉀溶液(1%,w/v)混合,在50 ℃中保溫20 min,取出冷卻后加入2 mL三氯乙酸(10%)充分混勻,然后5000 r/min離心10 min,取2 mL上清液加入2 mL蒸餾水和0.4 mL三氯化鐵溶液(0.1%,w/v)在50 ℃充分反應10 min,在700 nm處測定吸光度。以VC為陽性對照。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件分析數據及作圖,Box-Behnken設計采用Design Expert 8.0.6軟件并進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和胰蛋白酶5種蛋白酶,在各酶的適宜條件下進行酶解。由圖1可知,采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶這三種酶水解漢麻分離蛋白的水解度變化不顯著(P>0.05),而木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶水解漢麻分離蛋白得到的肽含量高于風味蛋白酶。由于堿性蛋白酶的酶切作用位點較多,屬于內切酶,可以先將肽鏈末端的疏水性氨基酸暴露出來,而木瓜蛋白酶是一種外切酶,可以將肽鏈末端的芳香族氨基酸釋放出來[22],所以為了后續更好地制備和分離高F值寡肽,本研究選擇堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行分步復合酶解。

圖1 不同蛋白酶對HPI酶解效果的影響Fig.1 Effect of different proteases on HPI enzymolysis注:字母相同表示無顯著性差異,P>0.05;字母不同表示 差異顯著,P<0.05；圖2～圖5、圖7～圖10，圖13～圖14同。

2.2 酶解方式對酶解效果的影響

經過篩選可得,采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復合酶解。分別采用將堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶同時加入,先加入堿性蛋白酶后加入木瓜蛋白酶和先加入木瓜蛋白酶后加入堿性蛋白酶三種方式進行酶解,研究不同酶解方式對酶解效果的影響。

由表5可知,當采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶先后使用時,HPI水解液的水解度和肽含量最大,分別達到20.36%和6.82 mg/mL,因此采用先堿性蛋白酶后木瓜蛋白酶的水解方式。

表5 酶解方式對酶解效果的影響Table 5 Effect of enzymolysis mode on enzymolysis effect

2.3 堿性蛋白酶水解條件的優化

2.3.1 pH對酶解效果的影響 由圖2可知,當pH小于8.0時,水解度和肽含量都逐漸增大;當pH為8.0時,水解度達到最大值(19.10%),pH為8.5時肽含量達到最大值,為5.1 mg/mL,此時的水解度為18.75%。與pH為8.0時的水解度相比,變化不顯著(P>0.05)。pH會影響酶的穩定性,pH大小不同,即溶液中OH-濃度不同,會影響蛋白酶自身的解離和底物的解離,從而影響酶解反應[23],所以溶液過酸或過堿會影響酶與底物的結合。因此,綜合考慮選擇最佳pH為8.5進行酶解實驗。這與梁凱[16]采用堿性蛋白酶單酶酶解火麻仁粕蛋白時得到的結果一致,當pH在7.0～8.5時,水解度逐漸增大,并確定最佳pH為8.5,當pH大于8.5時,水解度開始逐漸降低。因此，pH選擇為8.5。

圖2 pH對堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.2 Effect of pH value on enzymatic hydrolysis by alkaline protease

2.3.2 加酶量對酶解效果的影響 由圖3可知,隨著加酶量的逐漸增大,漢麻多肽的水解度和肽含量逐漸上升。當加酶量大于10000 U/g時,水解度和肽含量趨于平緩。可能在此階段酶解過程中,大分子蛋白減少,導致大分子蛋白與酶結合的幾率大大減少,酶分子達到飽和狀態[24]。進一步增加酶用量,水解度和肽含量增加不顯著。加酶量的多少決定漢麻蛋白水解后生成多肽的量,堿性蛋白酶作為一種內切酶,作用位點較多,可能使肽鏈充分水解。綜合考慮,確定最佳加酶量為10000 U/g。

圖3 加酶量對堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.3 Effect of alkaline protease addition on enzymatic hydrolysis

圖4 時間對堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis by alkaline protease

2.3.3 時間對酶解效果的影響 由圖4可知,當酶解時間在1～2 h之間時,水解度和肽含量的變化趨勢一致,隨著時間的增加,水解度和肽含量明顯增加,蛋白與酶充分反應,生成大量漢麻多肽;當酶解時間大于2 h后,反應幾乎停滯。原因可能是在反應初期,底物濃度較大,蛋白酶與底物作用效果明顯,隨著時間的延長,底物濃度逐漸降低[25],漢麻蛋白幾乎全部水解,水解度和肽含量幾乎不再變化。因此,選擇最佳酶解時間為2 h。

2.3.4 溫度對酶解效果的影響 溫度也是影響酶解效果的重要因素,由圖5可知,隨著溫度的升高,漢麻蛋白水解度和漢麻肽含量逐漸增大,在55 ℃時二者達到最大值,當溫度大于55 ℃時,水解度和肽含量緩慢減小,可能是由于反應體系溫度過高,使堿性蛋白酶活性降低,水解反應逐漸緩慢。酶的催化反應都有各自的最適溫度,溫度過高會影響蛋白酶的穩定性,使酶失活;其次酶促反應過程中,酶與底物、酶與抑制劑的結合都會受溫度的影響[26]。因此選擇最佳溫度為55 ℃。此結果與周徐慧[27]采用堿性蛋白酶制備抗氧化肽時得到的結果一致,同樣在55 ℃時水解度達到最大。

圖5 溫度對堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.5 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis by alkaline protease

2.3.5 響應面優化堿性蛋白酶水解條件 固定酶解反應條件底物濃度為5%,時間為2 h,選定對酶解效果影響較大的3種因素(加酶量、溫度、pH)作為響應面分析試驗的各因素,從而求出其最佳水解工藝條件。以pH(A)、溫度(B)、加酶量(C)作為自變量,以漢麻蛋白水解度(Y1)和酶解結束時溶液中的肽含量(Y2)為指標,設計三因素三水平試驗,響應面結果見表6。

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis for the regression model

采用Design-Expert V 8.0.6軟件對試驗數據進行回歸分析,得到的回歸方程為:

Y1=23.14-0.019A-0.92B+0.44C-0.70AB+0.10AC+0.49BC-1.88A2-2.29B2-1.59C2;

Y2=7.08+0.12A-0.37B+0.20C-0.31AB-0.04AC+0.29BC-0.54A2-0.60B2-0.42C2。

對方程進行顯著性及方差分析,結果見表7。

圖6 pH和溫度對水解度和肽含量的交互作用Fig.6 Interaction of pH and temperature on peptide content

該模型中三個因素對響應值的影響強弱可用F值來進行評價,各因素對漢麻蛋白肽的水解度和肽含量的影響順序為:溫度>加酶量>pH,其中溫度的影響極顯著(P<0.01),加酶量影響顯著(P<0.05),pH影響不顯著。對于因素間的交互作用,模型中只有AB交互作用顯著(P<0.05)。根據Design Expert軟件得出的回歸模型各因素相互之間作用如圖6所示。

響應曲面的交互圖中的橢圓排列越稀疏,各因素的變化對結果的影響越小;響應面圖斜度越大,響應值越敏感,對結果的影響越大[28]。由圖6可知,隨著溫度和pH的升高,水解度和肽含量呈先增加后減小的現象，AB交互作用顯著，與方差分析結果一致。該模型得到的堿性蛋白酶酶解最佳工藝條件為:pH為8.55,溫度為53.74 ℃,加酶量為10120.39 U/g,此時預測水解度為23.24%,肽含量為7.16 mg/mL。為了進一步驗證模型的可靠性,考慮到實際生產操作,將最佳堿性蛋白酶酶解工藝調整為:pH為8.5,溫度為54 ℃，加酶量為10100 U/g,并在此條件下重復3次試驗,實測水解度為22.95%,肽含量為7.06 mg/mL,與預測值較為接近,說明模型擬合較好。

2.4 木瓜蛋白酶水解條件的優化

2.4.1 pH對酶解效果的影響 由圖7可知,隨著pH的增加,水解度和肽含量均先增加后降低;當木瓜蛋白酶pH為6.5時,水解度和肽含量都達到最大值(22.58%和7.59 mg/mL);當pH高于6.5時,水解度和肽含量的變化趨勢都有一定程度的降低。這是因為酶的活性部位對反應體系的pH變化比較敏感,解離狀態隨pH變化而變化,這些變化會影響酶的空間構象,使蛋白酶的活力下降,反應達到一定的限度。綜合考慮,選擇木瓜蛋白酶pH為6.5。

圖7 pH對木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.7 Effect of pH on enzymatic hydrolysis by papain

2.4.2 加酶量對酶解效果的影響 木瓜蛋白酶的加酶量對酶解工藝的影響見圖8,在加酶量為2000～4000 U/g范圍內,隨著加酶量的增加,水解度和肽含量逐漸增加,沒有分解的大分子蛋白逐漸分解成小分子肽;當加酶量大于5000 U/g時,酶解達到飽和狀態,過量的酶不能與底物充分接觸,無法相互作用,因此再進一步增加酶量,使水解度和肽含量變化不顯著。考慮生產成本,選擇最佳加酶量為5000 U/g。

圖8 加酶量對木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.8 Effect of papain addition on enzymatic hydrolysis

圖9 時間對木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.9 Effect of time on enzymatic hydrolysis by papain

2.4.3 時間對酶解效果的影響 由圖9可知,當酶解時間為1.5 h時,肽含量達到最大值,此時的水解度大小與2 h的水解度相比變化不顯著(P>0.05)。隨著時間的延長,蛋白酶的活性開始逐漸下降,可見,木瓜蛋白酶酶解1.5 h后,隨著時間的延長,漢麻分離蛋白基本水解完全,部分多肽分解為氨基酸分布在溶液中,使肽含量降低。與其他因素相比,時間對于水解度和肽含量的影響較低,可能是因為選擇的時間范圍較窄,在此范圍內變化不明顯。所以,綜合考慮選擇酶解時間1.5 h,此時水解度為23.25%,肽含量為7.47 mg/mL。

2.4.4 溫度對酶解效果的影響 由圖10可知,當溫度為45～50 ℃時,水解度和肽含量逐漸增大,可能是由于溫度的升高,使酶活性中心與反應底物分子之間有效碰撞的幾率增大;當溫度為50 ℃時水解度和肽含量都達到最大值,當溫度大于50 ℃時,水解度和肽含量緩慢下降,可能是溫度過高,破壞了蛋白酶的特定空間構象,從而使酶活中心受到破壞,蛋白酶活性急劇下降,酶解效果降低。因此,選擇溫度為50 ℃。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis for the regression model

圖10 木瓜蛋白酶溫度對酶解效果的影響Fig.10 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis by papain

2.4.5 木瓜蛋白酶水解條件優化 選用木瓜蛋白酶進行第二步酶解,在單因素實驗的基礎上,固定底物濃度為5%,水解時間為1.5 h,選擇影響因素較大的pH(A)、溫度(B)、加酶量(C)進行二次回歸分析,以水解度(Y1)和肽含量(Y2)為響應值進行響應面優化試驗,試驗方案及結果見表8。

表8 Box-Behnken試驗設計與結果Table 8 Andexperimental results of Box-Behnken experimental design

采用Design-Expert V 8.0.6軟件對試驗數據進行回歸分析,得到的回歸方程為:

Y1=25.46-0.14A-1.17B+0.31C-0.70AB+0.35AC+0.99BC - 1.92A2- 1.58B2- 1.13C2;

Y2=8.08+0.12A - 0.37B+0.2C-0.3AB-0.04AC+0.29BC - 0.54A2- 0.6B2- 0.42C2。

對方程進行顯著性及方差分析,結果見表9。

圖11 水解度交互作用分析Fig.11 Interaction analysis of degree of hydrolysis

圖12 肽含量交互作用分析Fig.12 Interaction analysis of peptide content

該模型中三個因素對響應值的影響強弱可用F值來進行評價,各因素對漢麻蛋白肽的水解度和肽含量的影響順序為:溫度>加酶量>pH,其中溫度的影響極顯著(P<0.01),加酶量對肽含量影響顯著(P<0.05),pH影響不顯著。對于因素間的交互作用,模型中AB和BC交互作用對肽含量影響顯著(P<0.05)，BC交互作用對水解度影響顯著(P<0.05)。根據Design Expert軟件得出的回歸模型各因素相互之間作用如圖11和圖12所示。BC交互作用對水解度影響顯著，AB、BC交互作用對肽含量影響顯著(P<0.05)，與方差分析結果一致。

該模型得到的木瓜酶酶解最佳工藝條件為:pH為6.44,溫度為50.49 ℃,加酶量為5006.49 U/g,此時預測水解度的為24.68%,肽含量為8.54 mg/mL。為了進一步驗證模型的可靠性,考慮到實際生產操作,將最佳酶解工藝調整為:pH為6.5,溫度為50 ℃,加酶量為5000 U/g,并在此條件下重復3次試驗,實測水解度為24.48%,肽含量為8.48 mg/mL,與預測值較為接近,說明模型擬合較好。

2.5 漢麻蛋白肽抗氧化能力評價

DPPH自由基是一種穩定的含氮自由基,與乙醇溶液相混合后呈紫色,并在517 nm處具有最大的吸收峰[29]。抗氧化劑清除自由基的方式是通過自身的還原作用來給出電子,還原能力越強,代表其抗氧化活性就越強[30]。因此,當吸光度越大時,還原能力越強,說明抗氧化活性也越強。試驗研究了HPI酶解前后的DPPH自由基清除率和鐵還原能力。由實驗結果(圖13、圖14)可知,隨著樣品濃度的不斷增大,HPI和HPH的DPPH自由基清除率和鐵還原能力均不斷增加,陽性對照VC的活性最強,其中HPI的DPPH自由基清除率的IC50值為8.97 mg/mL,HPH的IC50值為6.37 mg/mL。且HPI酶解后的抗氧化能力均強于HPI本身,當樣品濃度為10 mg/mL時,DPPH自由基清除率達到了82.32%,鐵還原能力增加了29.6%,可能是蛋白酶對HPI水解后,大分子肽鏈被切斷,HPI的分子構象發生變化,暴露出其內部結構,一些具有抗氧化能力的氨基酸殘基也逐漸暴露出來,如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、組氨酸(His)和苯丙氨酸(Phe)等,這些氨基酸經研究具有抗氧化活性[31],王慶玲[32]在熱處理和pH偏移條件下對HPI的氨基酸組成的影響研究中,經測定含有這些具有抗氧化性的氨基酸且種類豐富,從而使HPI經過酶解后其抗氧化能力明顯上升。

圖13 不同濃度樣品的DPPH自由基清除率結果Fig.13 Results of scavenging rate of DPPH free radicals of samples with different concentrations

圖14 不同濃度樣品的鐵還原能力結果Fig.14 Results of iron reduction capacity of samples at different concentrations

3 結論

本研究采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復合分步酶解的方式制備漢麻蛋白肽。最終得到的最佳工藝條件為:堿性蛋白酶加酶量為10100 U/g,pH為8.5,溫度為54 ℃,酶解時間2 h;第二步木瓜蛋白酶加酶量為5000 U/g,pH為6.5,溫度為50 ℃,酶解時間1.5 h,分步酶解后得到的漢麻蛋白水解物的水解度和肽含量分別為24.48%和8.48 mg/mL。抗氧化結果表明漢麻多肽具有較好的DPPH自由基清除能力和鐵還原能力,說明漢麻抗氧化肽具有市場潛力,在食品保健領域有一定的開發利用價值。同時此工藝也為今后高F值漢麻寡肽的制備提供一定的理論基礎。今后還將對漢麻多肽的的結構、氨基酸組成和序列進行進一步分析。