好食脈孢霉發酵麥麩制備可溶性膳食纖維及其理化性質

許錫凱,辛嘉英,2,*,任佳欣,韓 燁,王廣交,崔添玉

(1.哈爾濱商業大學，省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076; 2.山西農業大學動物科技學院,山西晉中 030801)

膳食纖維(Dietary fiber,DF),被稱為第七大營養素,指既不能讓胃腸道消化吸收,也無法產生能量的一種多糖物質[1]。它是一種安全優質的可作為保健食品原輔料的功能性成分,按其水溶性分為可溶性膳食纖維(Soluble dietary fiber,SDF)和不溶性膳食纖維(Insoluble dietary fiber,IDF)[2]。其中SDF通過降低餐后血糖含量和血清膽固醇含量,不僅可以達到減肥的目的,還可以預防心臟病、腸胃病及糖尿病等疾病[3-4]。然而,目前我國成人平均膳食纖維的攝入量約為13.3 g/d,遠不足建議攝入量25～35 g/d[1],且天然來源的膳食纖維中SDF含量較少[2],需要采用化學法、酶法、發酵法、物理法等對天然原料改性,提高其SDF的得率和品質。這也是學者們近年來對膳食纖維的研究重點。

小麥麩皮是面粉加工的副產物,含有豐富的膳食纖維,約占總量的35%～50%[5]。由于人們早期對小麥麩皮的營養價值認識不夠全面,每年有2000 t麥麩直接被用作飼料,其價值未得到充分發揮,造成了嚴重浪費[6]。采用微生物發酵麩皮能夠切斷DF間的糖苷鍵從而將SDF釋放出來。對麩皮DF有很好的改性效果;且研究發現相較液態發酵,固態發酵更能有效提高產物的營養、口感品質和保質期[7],因此,采用固態發酵小麥麩皮提取SDF可以使小麥麩皮中的營養物質得到更充分更良好地利用。好食脈孢菌是被食品藥品監督管理局(FDA)定為“GRAS,Generally Recognized as Safe”(認定安全)的生物體[8],民間悠久的使用歷史也佐證了其安全性,加上好食脈孢菌代謝旺盛,生長速度快,其最大比生長速率可達0.4 h-1,是其它普通的工業真菌如黑曲霉(A.niger)和產黃青霉(P.chrysogennum)的兩、三倍[9]。該微生物代謝產物中含有多種水解酶[10-13],其中纖維素酶和木聚糖酶產量較多,且其對SDF的釋放也是事關重要的,因此可以將其作為固態發酵麩皮的優選菌種。凌阿靜等[14]采用了黑曲霉、米曲霉、里氏木霉分別對麥麩進行固態發酵,發現里氏木霉固態發酵7 d,麥麩可溶性膳食纖維的得率及其抗氧化性顯著提高。閔鐘熳等[15]采用枯草芽孢桿菌固態發酵米糠粕,發現發酵時間22.4 h、發酵溫度35 ℃、接種量6.6%時,SDF得率為12.88%。

本研究采用好食脈孢霉對小麥麩皮進行固態發酵,研究該過程中含水量、接種量、發酵溫度、發酵時間對麥麩SDF得率的影響,采用響應面法Box-Behnken優化培養基的最佳發酵條件,并對發酵前后麥麩SDF的理化性質進行對比,以期為麥麩SDF作為食品添加劑的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

好食脈孢霉(Neurosporssitophila) 哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室保存;小麥麩皮 山東濰坊面粉廠;葡萄糖、瓊脂、氯化鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸鈉、冰醋酸、乙酸鈉、羧甲基纖維素鈉、無水乙醇、磷酸二氫鈉 市售分析純,國藥集團化學試劑有限公司;膽固醇、鄰苯二甲醛、DPPH、木聚糖 市售分析純,上海源葉生物科技有限公司;木聚糖酶、纖維素酶、3,5-二硝基水楊酸 上海季藍科技發展有限公司;花生油、雞蛋 均為市售。

LRH-250-Gb恒溫培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司;HZQ-D恒溫振蕩器 中國哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;TDL-40-B高速離心機 上海知正離心機有限公司;LDZX-40-AI立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;島津UV-2450紫外可見光譜儀 島津-GL消耗品銷售公司;HWS-24型恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;FDU-1200冷凍干燥機 京東理化器械株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 PDA斜面培養基的制備及菌體培養 將200 g新鮮去皮馬鈴薯碎加入到1000 mL沸水中煮30 min,期間不斷攪拌,冷卻后通過8層紗布過濾得濾液,用蒸餾水補足至1 L,并向其中加入20 g葡萄糖,20 g瓊脂,待全部溶解后,分裝到10個250 mL錐形瓶中。在121 ℃高壓滅菌20 min,取出后斜面45 ℃放置凝固即可。將4 ℃保存的好食脈孢霉的孢子接至培養基斜面上,30 ℃培養3 d。

1.2.2 好食脈孢霉種子菌懸液的制備 取0.9%生理鹽水50 mL(含20個小玻璃珠)置于250 mL錐形瓶中,并121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。取出冷卻后,將生理鹽水分多次倒入上述培養3 d的PDA培養基中,輕輕晃動三角瓶,將培養基表面的孢子沖洗干凈。封口后置于180 r/min搖床,4 ℃恒溫振蕩1 h。即得種子菌懸液。

1.2.3 麥麩培養基的制備 稱取5 g已烘干至恒重的小麥麩皮于250 mL錐形瓶中,加入硫酸銨0.5%(v/w)、葡萄糖0.6%(v/w)、磷酸二氫鉀0.5%(v/w)、硫酸鎂0.25%(v/w),調節固態培養基至一定的含水量,于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻后備用。

1.2.4 單因素實驗 取上述麥麩培養基,以接種量10%、含水量70%、發酵溫度30 ℃、培養時間72 h作為基本條件,通過改變單一因素來探究其對SDF得率的影響。分別將接種量8%、10%、12%、14%和16%(v/w)的好食脈孢霉菌懸液接于固態發酵培養基中,并向培養基中添加蒸餾水,使菌懸液與培養基中總含水量分別為50%、60%、70%、80%和90%(v/w),在25、30、35、40和45 ℃下培養24、48、72、96、120和144 h,發酵結束后,將其置于105 ℃的烘箱中烘干至恒重。以未接菌的麩皮培養基為對照。

1.2.5 響應曲面試驗設計 應用Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設計構建模型,利用響應曲面法尋找最優發酵條件。以接種量(A)、含水量(B)、發酵溫度(C)、發酵時間(D)4個因素為自變量,SDF得率(%)為響應值,運用四因素三水平的響應面分析試驗。試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of Box-Behnken experimental design

1.2.6 SDF的提取及得率的計算 準確稱取2.00 g發酵后并干燥的樣品,研磨過60目篩,以1∶25 (w/v)料液比加入蒸餾水,在85 ℃水浴鍋中浸提2 h,期間加以攪拌,冷卻后離心(4000 r/min 20 min)得濾液,加入4倍體積的無水乙醇(v/v),于4 ℃靜置過夜后,50 ℃,130 r/min旋轉蒸發至無醇味,冷凍干燥24 h得SDF粉末。

式中:M0為冷凍干燥后麥麩SDF的質量,g;M為小麥麩皮樣品的干質量,g。

1.2.7 發酵過程中酶活力的測定

1.2.7.1 粗酶液的制備 將20 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(0.05 mol/L pH4.8)加入發酵好的2 g固態培養基中。置于30 ℃ 180 r/min恒溫搖床浸提1 h。取出抽濾后的浸提液,并在4 ℃ 8000 r/min離心15 min,獲得的上清液為粗酶液。

1.2.7.2 纖維素酶活性測定 參考趙玉萍等[16]方法相應改進后進行測定。取1 mL,1%羧甲基纖維素鈉溶液(用0.2 mol/L pH4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制),加入0.5 mL適當稀釋的酶溶液,在50 ℃的恒溫下酶解30 min。取出立即加入2 mL,3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑以終止反應。然后在100 ℃水浴中煮沸5 min,冷卻至室溫后定容至25 mL并充分搖勻,并在540 nm下測量吸光度OD值。

纖維素酶活力定義為pH=4.8,50 ℃,每分鐘產生1 μg木糖所需要的酶量為一個纖維素酶活力單位,用U/mL表示。

對照組:加入用沸水將粗酶溶液滅活5 min的粗酶液0.5 mL,并按照上述步驟進行。

1.2.7.3 木聚糖酶活性的測定 參考李彩霞等[17]方法相應改進后進行測定。取0.1 mL適當稀釋的酶溶液(在50 ℃水浴中預熱5 min)并加入0.9 mL預熱過的1%的木聚糖(用0.2 mol/L pH4.8醋酸-醋酸鈉緩沖液配置)混合后50 ℃酶解30 min。快速加入1.0 mL緩沖液和1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑以停止反應,然后在沸水中煮沸5 min,冷卻至室溫后定容至25 mL并充分搖勻,并在540 nm下測量吸光度OD值。

木聚糖酶活力定義為pH=4.8,50 ℃,每分鐘產生1 μg木糖所需要的酶量為一個木聚糖酶活力單位,單位為U/mL。

對照組:加入用沸水將粗酶溶液滅活5 min的粗酶液0.1 mL,并按照上述步驟進行。

1.2.8 SDF理化性質測定 SDF溶解度的測定,參考徐廣超[18]報道的方法進行測定;膽固醇吸附作用的測定,參考歐仕益等[19]報道的方法進行測定;葡萄糖吸附作用的測定,參考Peerajit等[20]報道的方法進行測定;DPPH清除能力的測定,參考薛山等[21]報道的方法進行測定。

1.3 數據處理

實驗重復3次,利用Excel 2019、SPSS 23.0軟件處理實驗數據,采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Benhnken設計響應面數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 接種量對發酵小麥麩皮SDF得率的影響 如圖1所示,隨著接種量的增加SDF得率呈先上升后下降趨勢。接種量為10%(v/w)時,SDF得率最高為13.35%,當接種量低于10%(v/w)時,菌體分泌水解酶的量過少,不能將植物細胞壁的致密結構完全破壞,致使SDF得率低。當接種量高于10%(v/w)時,培養基中的營養物質不能滿足微生物的正常代謝,SDF將被消耗。因此,接種量選擇8%～12%(v/w)進行后續響應面分析。

圖1 接種量對SDF得率的影響Fig.1 Effect of inoculum volume on the yield of wheat bran SDF注:不同字母間表示具有顯著性差異(P<0.05);圖2～圖4，圖6、圖7同。

2.1.2 含水量對發酵小麥麩皮SDF得率的影響 如圖2所示,隨著含水量的增加,SDF得率呈先上升后下降趨勢。含水量為70%(v/w)時,SDF得率最高為13.23%,當含水量低于70%(v/w)時,培養基中的水分不能夠維持好食脈孢霉的正常生長,同時影響著菌體的產酶速度[22]。當含水量高于70%(v/w)時培養基出現了結塊現象,對菌體的透氣性和溶解性[23]產生影響。因此,含水量選擇60%～80%(v/w)進行后續響應面分析。

圖2 含水量對SDF得率的影響Fig.2 Effect of initial water content on the yield of wheat bran SDF

2.1.3 發酵溫度對發酵小麥麩皮SDF得率的影響 如圖3所示,隨著發酵溫度的增加，SDF得率呈先上升后下降趨勢。發酵溫度為30 ℃時,SDF得率達最高為11.87%,當發酵溫度低于30 ℃時,微生物的代謝速度減慢,產酶速度受到抑制。當發酵溫度高于30 ℃時,菌種過早老化[24],發酵周期縮短,使產量降低。因此,發酵溫度選擇25～35 ℃進行后續響應面分析。

圖3 發酵溫度對SDF得率的影響Fig.3 Effect of temperature of fermentation on the yield of wheat bran SDF

2.1.4 培養時間對發酵小麥麩皮SDF得率的影響 如圖4所示,隨著發酵時間的增加SDF得率呈先上升后下降趨勢。發酵時間為72 h時SDF得率最高,為12.21%。當發酵時間低于72 h時,發酵時間過短不利用酶的合成。當發酵時間高于72 h時,可能是因為培養基中有害代謝產物的不斷累積,發生菌體自溶現象,使酶活性降低,也可能是因為培養基中的營養物質不足,大分子SDF被分解成小分子糖類。因此,發酵時間選擇48～96 h進行后續響應面分析。

圖4 發酵時間對SDF得率的影響Fig.4 Effect of time course of fermentation on the yield of wheat bran SDF

2.2 響應面模型的建立與顯著性分析

為最大限度地提高麥麩SDF的得率,綜合上述單因素實驗結果,選取了接種量(A)、含水量(B)、發酵溫度(C)、發酵時間(D)4個因素進行優化,以麥麩SDF得率(Y)為指標,進行四因素三水平Box-Behnken響應面設計。結果如表2所示。通過Design-Expert 8.06對表2結果進行分析,得到的3因素與麥麩SDF得率之間的回歸模型可以表述為:13.18+0.2942A+0.7408B+0.0508C+0.5058D+0.2275AB-0.2250AC-0.2850AD+0.0575BC+0.4725BD-0.3000CD-0.2955A2-1.37B2-0.7230C2-0.6055D2

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental results

表3 回歸統計分析結果Table 3 Analysis of variances for SDF yield various extraction conditions

圖5 因素相互作用對麥麩SDF得率影響的響應面Fig.5 Response surface plots for the effect of SDF of wheat bran yield

從圖5可知A(接種量)與B(含水量)、B(含水量)與D(發酵時間)因素見等高線形狀為明顯的橢圓形,說明交互作用較顯著,且麥麩SDF得率隨A、B、C、D的增加呈現先增加后減小的趨勢,通過響應曲面設計優化得到最佳工藝條件:接種量11.11%(v/w)、含水量74.21%(v/w)、發酵溫度29.33 ℃、發酵時間83.63 h。根據實際操作方便性,選取接種量11%(v/w)、含水量74%(v/w)、發酵溫度29 ℃、發酵時間為83.5 h為最佳發酵條件,在此條件下進行3次重復驗證實驗,發酵后的麥麩SDF的實際得率的平均值為13.41%與預測值13.53%偏差較小,無顯著性差異(P>0.05),說明該模型科學可行。

2.3 小麥麩皮發酵過程中酶活力的變化及麥麩SDF得率與酶活力變化的相關性分析

2.3.1 纖維素酶和木聚糖酶活性變化 為了說明好食脈孢霉固態發酵小麥麩發皮過程中木聚糖酶和纖維素酶活性與SDF得率的相關性,對這2種酶活性進行了測定。由圖6、圖7可知,這2種酶活力均呈先上升后下降的趨勢,木聚糖酶活力在發酵96 h時達最高,為404.2 U/mL,纖維素酶活力在發酵72 h達最高,為121.09 U/mL,發酵96 h后,這2種酶活力均開始明顯下降。對比圖4可知這2種酶活力與麥麩SDF得率趨勢大致相同,說明了麥麩SDF得率與發酵過程中產生的木聚糖酶活力與纖維素酶活力具有密不可分的關系。

圖6 發酵時間對木聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of time course of fermentation on the activity of the xylanse

圖7 發酵時間對纖維素酶活力的影響Fig.7 Effect of time course of fermentation on the activity of the cellulose

2.3.2 麥麩SDF得率與酶活力變化的相關性分析 現分別以木聚糖酶活力、纖維素酶活力為橫坐標,麥麩SDF得率為縱坐標,繪制回歸曲線。探究這2種酶活力與麥麩SDF得率相關性。

由圖9、圖10可知,SDF得率與木聚糖酶活性和纖維素酶活性呈正相關,決定系數R2分別為0.7752和0.8641,總體來看這2種酶活力越強越有利于麥麩SDF的獲得,這是因為這2種酶能將以β-1,4糖苷鍵連接在小麥麩皮細胞壁上的纖維素與半纖維素斷裂[25-26],使IDF向SDF轉化,進而SDF得率增加。但通過把圖4、圖6結合分析發現,隨著木聚糖酶活力的增加,SDF得率呈現先上升后下降趨勢,這可能是因為隨著木聚糖酶活力的逐漸增加,木聚糖酶對麥麩SDF釋放起到先促進后抑制的作用,麥麩SDF主要是由葡聚糖、戊聚糖、低聚木糖[27]等糖類物質組成,當木聚糖酶活力過高時會將提取得到的大分子糖類進一步水解為小分子糖類,難以醇沉,則導致麥麩SDF得率降低。因此控制好發酵條件是獲得更多SDF的重要前提。

圖8 麥麩SDF得率與木聚糖酶活力的相關性Fig.8 Correlation between SDF of wheat bran yield and xylanase activity

圖9 麥麩SDF得率與纖維素酶活力的相關性Fig.9 Correlation between SDF of wheat bran yield and cellulase activity

2.4 發酵前后麥麩SDF理化性質的測定

由表4可知,好食脈孢霉固態發酵后的麥麩SDF的溶解性為88.50%,比發酵前提高了1.14倍,高于張榮[28]、李艷[29]等,同等條件下(25 ℃、pH=7)測得的小米、馬鈴薯SDF溶解度。優良的溶解性可以使麥麩SDF作為飲料、乳制品等的功能性添加劑。發酵后麩皮SDF的葡萄糖吸附力為14.4 mmol/g,比發酵前提高了1.76倍。因此,發酵后的麩皮SDF具有一定的降低餐后血糖濃度的功效,且在一定程度上可以緩解糖尿病患者對葡萄糖的吸收速率[30]。發酵后SDF對膽固醇的吸附力在pH=2和pH=7時分別為1.59和1.85 mg/g,顯著(P<0.05)高于未發酵的麩皮SDF的膽固醇吸附力,分別提高了5.36和4.61倍，將其作為食品添加劑使用時可以延緩對體內多余膽固醇的吸收[31],起到一定的預防腸道疾病的作用。另外,環境的酸堿度對麥麩SDF膽固醇吸附力也有較大的影響,在pH=7時(模擬小腸的中性環境)小麥麩皮SDF的膽固醇吸附力高于pH=2時(模擬胃的酸性環境)的膽固醇吸附力,這也與人體的實際消化環境相符,人體小腸(pH=7)是膽固醇主要的消化吸收場所[32]。同時發酵后的麩皮SDF的DPPH清除率高達77.52%,比發酵前提高了1.62倍，具有良好的抗氧化活性。因此,好食脈孢霉固態發酵小麥麩皮可有效地提高麩皮SDF的理化性質,進而得到較高品質的麥麩SDF,為其作為食品添加劑提供了一定的理論依據。

表4 發酵前后麥麩SDF功能特性的變化Table 4 Changes in functional characteristics of SDF before and after

3 結論

通過響應曲面法對固態發酵小麥麩皮釋放SDF發酵條件進行優化,得到最佳工藝參數:含水量為74%(v/w)、接種量為11%(v/w)、發酵溫度為29 ℃、發酵時間為83.5 h時麥麩SDF得率最高為13.41%。測定了好食脈孢霉發酵小麥麩皮過程中主要產生的纖維素酶活力和木聚糖酶活力。發現這2種酶活力與麥麩SDF得率呈顯著正相關(P<0.05),但微生物發酵過程中分泌的水解酶活力不是越高越好。因此,控制發酵過程中酶的分泌量也是至關重要的。測得在最優工藝參數下得到的麥麩SDF溶解性、膽固醇吸附能力、葡萄糖吸附能力、DPPH清除能力均有顯著提高,為麥麩SDF作為食品添加劑領域奠定堅實基礎。